實(shí)驗(yàn)+細(xì)菌的芽孢染色法

1、實(shí)驗(yàn)五、細(xì)菌的芽孢染色法,實(shí)驗(yàn)的目的要求,學(xué)習(xí)并掌握芽孢染色法進(jìn)一步了解芽孢桿菌的形態(tài)特征,,細(xì)菌芽孢的基本構(gòu)造,,孢外壁芽孢衣皮層芽孢壁芽孢質(zhì)膜芽孢質(zhì)芽孢核區(qū),芽胞具有多層厚而致密的胞膜，由內(nèi)向外依次為核心、內(nèi)膜、芽胞壁、皮質(zhì)、外膜、芽胞殼和芽胞外衣 .,形成芽孢需要一定的外界條件，這些條件因菌種而異。炭疽芽孢桿菌在有氧(O2)條件下才能形成芽孢，而破傷風(fēng)芽孢桿菌則在無氧條件下形成芽孢。通常細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)不足時(shí)形成芽胞，但蘇

2、云金芽孢桿菌是例外。,,細(xì)菌芽孢的基本特性,細(xì)菌芽孢的基本特性,芽孢對(duì)惡劣環(huán)境條件有很強(qiáng)的抵抗能力，尤其耐高溫。有的芽胞可耐100℃沸水煮沸數(shù)小時(shí)。在一定條件下，芽孢保持活力數(shù)年至數(shù)十年之久。高溫滅菌的判斷標(biāo)準(zhǔn)就是細(xì)菌的芽孢是否被殺滅。,細(xì)菌芽孢的基本特性,芽孢在適宜條件下，營(yíng)養(yǎng)物如葡萄糖、乳酸和水分，會(huì)發(fā)芽形成菌體，但細(xì)菌的數(shù)量并未增加，所以芽胞不是一種繁殖方式。,芽胞抵抗力強(qiáng)的原因,1.芽胞含水量少，蛋白質(zhì)受熱后不易變性；2.芽胞

3、具有多層致密的厚膜，理化因素不易透入；3.芽胞中含有一種特有的化學(xué)組分吡啶二羧酸（DPA），DPA與鈣結(jié)合生成的鈣鹽能提高芽胞中各種酶的熱穩(wěn)定性。,細(xì)菌芽孢染色的意義,芽孢又稱內(nèi)生孢子，是某些細(xì)菌生長(zhǎng)到一定階段在菌體內(nèi)形成的休眠體，通常呈圓形或橢圓形。細(xì)菌能否形成芽孢以及芽孢的形狀、芽孢在芽孢囊內(nèi)的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鑒定細(xì)菌的依據(jù)之一。,,細(xì)菌的芽孢具有厚而致密的壁不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽孢不著色(芽孢

4、呈無色透明狀)。芽孢染色法就是根據(jù)芽孢既難以染色而一旦染上后又難以脫色這一特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。,,細(xì)菌芽孢染色原理,細(xì)菌芽孢染色原理,所有的芽孢染色法都基于同一個(gè)原則：除了用著色力強(qiáng)的染料外，還需要加熱，以促進(jìn)芽孢著色，再使菌體脫色，而芽孢上的染料則難以滲出，故仍保留原有的顏色，然后用對(duì)比度強(qiáng)的染料對(duì)菌體復(fù)染，使菌體和芽孢呈現(xiàn)出不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽孢，便于觀察。,材料,菌種:蘇云金芽孢桿菌蠟樣芽孢桿菌染色劑：5%孔雀綠

5、水溶液0.5%番紅水溶液儀器或其他用具：Eppendorf管Eppendorf管架載玻片顯微鏡電磁爐搪瓷燒杯,,方法,Schaeffer-Fulton氏染色法(P78)改良的Schaeffer-Fulton氏染色法,,,制片染色脫色復(fù)染鏡檢,Schaeffer-Fulton氏染色法,,,制備菌懸液染色涂片固定脫色復(fù)染鏡檢,改良的Schaeffer-Fulton氏染色法,,,制 片,,,,生理鹽水

6、,,1、滴生理鹽水,挑取少量菌苔,與生理鹽水混勻均勻涂布,或電吹風(fēng)吹干,2、涂片,滴半滴生理鹽水在載玻片中央,3、干燥,室溫自然晾干,,,染 色,,5%孔雀綠染液,,,1、滴孔雀綠染液,滴加數(shù)滴孔雀綠染液在菌膜上,,2、加熱染色,用木夾夾住載玻片一端，在微火上加熱,至冒蒸汽開始計(jì)時(shí)，維持5min,,,,沸騰：菌體或芽孢囊破裂；加熱不夠：芽孢難以著色。,注意補(bǔ)充染液，以免涂片干涸,脫色,,待玻片冷卻后，水洗脫色,

7、不要直接沖菌膜,復(fù) 染,,0.5%番紅水溶液,,,1、滴番紅水溶液,滴加數(shù)滴番紅染液在菌膜上，染色2min,,2、水洗,,不要直接沖菌膜,鏡 檢,,或吸水紙吸干,,1、干燥,或電吹風(fēng)吹干,室溫自然晾干,2、鏡檢,顯微鏡操作,油鏡使用,,,制備菌懸液,,,,生理鹽水,,1、滴生理鹽水,挑取2-3環(huán)菌苔,與生理鹽水混勻均勻,2、制備菌懸液,在EP管中滴2滴生理鹽水,,染色,,,5%孔雀綠染液,,1、滴加孔雀綠染液,沸水