實(shí)驗(yàn)2 細(xì)菌的芽孢染色和莢膜染色

1、1實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌的芽孢染色和莢膜染色生物111班楊明軒1102040128一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌芽胞染色的原理和方法。2、學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌莢膜染色的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理（一）細(xì)菌的芽孢染色芽孢通常指某些細(xì)菌在生長(zhǎng)后期于細(xì)胞內(nèi)形成的一種圓形、橢圓形或圓柱形的、厚壁、折光性高、含水量極低而抗逆性極強(qiáng)的內(nèi)生休眠體。芽孢染色法是利用細(xì)菌的芽孢和菌體對(duì)染色劑親合力不同的原理，用不同的染料進(jìn)行著色，使芽孢和菌體呈現(xiàn)出不同的顏色而加以區(qū)別。芽孢

2、通常具有厚而致密的壁，透性低，不易著色和脫色，當(dāng)用著色力強(qiáng)的弱堿性染色劑孔雀綠在加熱條件下染色師，芽孢和菌體同時(shí)著色，進(jìn)入菌體的染色劑可經(jīng)水洗脫色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出。經(jīng)對(duì)比度大的復(fù)染液番紅染色后，芽孢仍保留初染劑的顏色，呈綠色；而菌體被復(fù)染劑染成紅色，易于區(qū)別。（二）細(xì)菌的莢膜染色莢膜是包圍細(xì)菌細(xì)胞的一層粘液性物質(zhì)，具有明確的外緣，牢固地附著在菌體細(xì)胞壁外；莢膜的主要成分是多糖，不易著色，其含水量高達(dá)90%以上，易變形。莢膜染

3、色通常采用襯托染色法或稱(chēng)負(fù)染法，即將菌體和背景分別著色，從而把不著色且透明的莢膜給襯托出來(lái)。三、實(shí)驗(yàn)材料1、菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），26~28℃培養(yǎng)2~3天；鉀細(xì)菌（Bacillusmucilaginosus），點(diǎn)接于阿須貝平板上，26~28℃培養(yǎng)3天。2、染色劑：孔雀綠染液、番紅染液，石炭酸復(fù)紅、墨汁（已過(guò)濾）3、其他：載玻片、無(wú)菌水、洗瓶、擦鏡紙、吸水紙、二甲苯、香柏油、接種用具四、實(shí)驗(yàn)方法（一）細(xì)菌

4、的芽孢染色1、制片：將枯草芽孢桿菌涂片、干燥固定。2、染色：用吸水紙塊蓋住涂片處，然后在吸水紙張滴加孔雀綠染液至飽和。加熱使染液微冒蒸汽后，保持5min。加熱時(shí)應(yīng)不斷添加染液，不要使吸水紙干燥。3、水洗：待玻片冷卻后，用鑷子除去吸水紙，再用水平輕輕沖洗至孔雀綠不再褪色為止。4、復(fù)染：用番紅染液染色2~3min。5、鏡檢：涂片干燥后，置油鏡下觀察。6、清理：整理桌面，將顯微鏡恢復(fù)原樣，將廢片放入廢片缸內(nèi)。（二）細(xì)菌的莢膜染色1、制片：在潔

5、凈的載玻片的中央滴加1滴無(wú)菌水，取少許鉀細(xì)菌制成涂片，在空氣中風(fēng)干。2、染色：用石炭酸復(fù)紅在涂片處染色4~5min，水洗，稍風(fēng)干。3、滴加一滴墨汁在載玻片的一側(cè)，左手持此玻片，右手拿一干凈玻片作推片用。將推片邊緣憑證的一端與混合菌液成30膠接觸，順勢(shì)將菌液推開(kāi)（不要太用力），使其涂成一薄層，并在空氣中充分自然干燥。24、鏡檢：玻片自然干燥后，置油鏡下觀察。6、清理：整理桌面，將顯微鏡恢復(fù)原樣，將廢片放入廢片缸內(nèi)。六、思考題1、為什么在孔

6、雀綠加熱染色時(shí)，要待玻片冷卻后才能沖洗？答：因?yàn)榻?jīng)過(guò)加熱后細(xì)菌提和孢子體均會(huì)因加熱膨脹，如果此時(shí)沖洗冷卻會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌體和孢子體因?yàn)闊崦浝淇s過(guò)于劇烈而發(fā)生形變從而影響兩者之間形狀區(qū)別的觀察。同時(shí)對(duì)于玻片也會(huì)因?yàn)闊崦浝淇s原因可能會(huì)產(chǎn)生炸裂損壞玻片，造成傷害。2、分別從菌齡、制片等方面，簡(jiǎn)述細(xì)菌芽胞染色需要注意的技術(shù)要領(lǐng)。答：（1）進(jìn)行芽孢染色的菌株應(yīng)注意其培養(yǎng)時(shí)間。如菌株培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，芽孢則從菌體脫落出來(lái)；如培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，達(dá)不到細(xì)菌生長(zhǎng)的后期

7、，則可能出現(xiàn)芽孢數(shù)量較少的現(xiàn)象。（2）染色時(shí)，用吸水紙蓋住涂片并加熱是為了讓染色劑更好的進(jìn)入芽孢。但加熱時(shí)要注意加熱到微冒蒸汽即可，不要使染液沸騰，并注意不斷添加染液。（3）加熱完成后，有等玻片自然冷卻后在進(jìn)行水洗，而且水洗要充分。3、簡(jiǎn)單染色能否觀察細(xì)菌莢膜？請(qǐng)解釋原因。答：不可以。因?yàn)榍v膜是包圍細(xì)菌細(xì)胞的一層粘液性物質(zhì)，具有明確的外緣，牢固地附著在菌體細(xì)胞壁外；莢膜的主要成分是多糖，不易著色，其含水量高達(dá)90%以上，易變形。簡(jiǎn)單的染

8、色法原理是將莢膜染色，但是莢膜含水量極高，無(wú)法著色。因此無(wú)法通過(guò)簡(jiǎn)單染色觀察。4、細(xì)菌的莢膜有何特點(diǎn)，在對(duì)其染色觀察結(jié)果時(shí)應(yīng)注意什么？答：（1）莢膜是包圍細(xì)菌細(xì)胞的一層粘液性物質(zhì)，具有明確的外緣，牢固地附著在菌體細(xì)胞壁外；莢膜的主要成分是多糖，不易著色，其含水量高達(dá)90%以上，易變形。（2）由于莢膜的含水量極高，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中為了保持莢膜的形態(tài)，制片不能用火烤，以免莢膜失水后形態(tài)改變。莢膜有一定的粘性，因此取菌時(shí)要少取些，涂菌是要盡量