實驗2 細菌的芽孢染色和莢膜染色

1、1實驗二細菌的芽孢染色和莢膜染色生物111班楊明軒1102040128一、實驗目的1、學習并掌握細菌芽胞染色的原理和方法。2、學習并掌握細菌莢膜染色的原理和方法。二、實驗原理（一）細菌的芽孢染色芽孢通常指某些細菌在生長后期于細胞內形成的一種圓形、橢圓形或圓柱形的、厚壁、折光性高、含水量極低而抗逆性極強的內生休眠體。芽孢染色法是利用細菌的芽孢和菌體對染色劑親合力不同的原理，用不同的染料進行著色，使芽孢和菌體呈現(xiàn)出不同的顏色而加以區(qū)別。芽孢

2、通常具有厚而致密的壁，透性低，不易著色和脫色，當用著色力強的弱堿性染色劑孔雀綠在加熱條件下染色師，芽孢和菌體同時著色，進入菌體的染色劑可經水洗脫色，而進入芽孢的染料則難以透出。經對比度大的復染液番紅染色后，芽孢仍保留初染劑的顏色，呈綠色；而菌體被復染劑染成紅色，易于區(qū)別。（二）細菌的莢膜染色莢膜是包圍細菌細胞的一層粘液性物質，具有明確的外緣，牢固地附著在菌體細胞壁外；莢膜的主要成分是多糖，不易著色，其含水量高達90%以上，易變形。莢膜染

3、色通常采用襯托染色法或稱負染法，即將菌體和背景分別著色，從而把不著色且透明的莢膜給襯托出來。三、實驗材料1、菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），26~28℃培養(yǎng)2~3天；鉀細菌（Bacillusmucilaginosus），點接于阿須貝平板上，26~28℃培養(yǎng)3天。2、染色劑：孔雀綠染液、番紅染液，石炭酸復紅、墨汁（已過濾）3、其他：載玻片、無菌水、洗瓶、擦鏡紙、吸水紙、二甲苯、香柏油、接種用具四、實驗方法（一）細菌

4、的芽孢染色1、制片：將枯草芽孢桿菌涂片、干燥固定。2、染色：用吸水紙塊蓋住涂片處，然后在吸水紙張滴加孔雀綠染液至飽和。加熱使染液微冒蒸汽后，保持5min。加熱時應不斷添加染液，不要使吸水紙干燥。3、水洗：待玻片冷卻后，用鑷子除去吸水紙，再用水平輕輕沖洗至孔雀綠不再褪色為止。4、復染：用番紅染液染色2~3min。5、鏡檢：涂片干燥后，置油鏡下觀察。6、清理：整理桌面，將顯微鏡恢復原樣，將廢片放入廢片缸內。（二）細菌的莢膜染色1、制片：在潔

5、凈的載玻片的中央滴加1滴無菌水，取少許鉀細菌制成涂片，在空氣中風干。2、染色：用石炭酸復紅在涂片處染色4~5min，水洗，稍風干。3、滴加一滴墨汁在載玻片的一側，左手持此玻片，右手拿一干凈玻片作推片用。將推片邊緣憑證的一端與混合菌液成30膠接觸，順勢將菌液推開（不要太用力），使其涂成一薄層，并在空氣中充分自然干燥。24、鏡檢：玻片自然干燥后，置油鏡下觀察。6、清理：整理桌面，將顯微鏡恢復原樣，將廢片放入廢片缸內。六、思考題1、為什么在孔

6、雀綠加熱染色時，要待玻片冷卻后才能沖洗？答：因為經過加熱后細菌提和孢子體均會因加熱膨脹，如果此時沖洗冷卻會導致細菌體和孢子體因為熱脹冷縮過于劇烈而發(fā)生形變從而影響兩者之間形狀區(qū)別的觀察。同時對于玻片也會因為熱脹冷縮原因可能會產生炸裂損壞玻片，造成傷害。2、分別從菌齡、制片等方面，簡述細菌芽胞染色需要注意的技術要領。答：（1）進行芽孢染色的菌株應注意其培養(yǎng)時間。如菌株培養(yǎng)時間過長，芽孢則從菌體脫落出來；如培養(yǎng)時間過短，達不到細菌生長的后期

7、，則可能出現(xiàn)芽孢數量較少的現(xiàn)象。（2）染色時，用吸水紙蓋住涂片并加熱是為了讓染色劑更好的進入芽孢。但加熱時要注意加熱到微冒蒸汽即可，不要使染液沸騰，并注意不斷添加染液。（3）加熱完成后，有等玻片自然冷卻后在進行水洗，而且水洗要充分。3、簡單染色能否觀察細菌莢膜？請解釋原因。答：不可以。因為莢膜是包圍細菌細胞的一層粘液性物質，具有明確的外緣，牢固地附著在菌體細胞壁外；莢膜的主要成分是多糖，不易著色，其含水量高達90%以上，易變形。簡單的染

8、色法原理是將莢膜染色，但是莢膜含水量極高，無法著色。因此無法通過簡單染色觀察。4、細菌的莢膜有何特點，在對其染色觀察結果時應注意什么？答：（1）莢膜是包圍細菌細胞的一層粘液性物質，具有明確的外緣，牢固地附著在菌體細胞壁外；莢膜的主要成分是多糖，不易著色，其含水量高達90%以上，易變形。（2）由于莢膜的含水量極高，因此在實驗過程中為了保持莢膜的形態(tài)，制片不能用火烤，以免莢膜失水后形態(tài)改變。莢膜有一定的粘性，因此取菌時要少取些，涂菌是要盡量