藥物質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)指導(dǎo)原則

1、第十四章生物藥物質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證,,1,第十四章 生物藥物質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證,一、概述二、生物學(xué)測(cè)定常用方法 三、方法的來源四、分析方法五、分析方法的驗(yàn)證六、綜合分析,2,鏈霉素,3,一、概述,保證藥品安全、有效、質(zhì)量可控是藥品研發(fā)和評(píng)價(jià)應(yīng)遵循的基本原則，其中，對(duì)藥品進(jìn)行質(zhì)量控制是保證藥品安全有效的基礎(chǔ)和前提。方法驗(yàn)證的目的是判斷采用的分析方法是否科學(xué)、合理，是否能有效控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。,4,生物藥品質(zhì)控,生物

2、藥品質(zhì)控中采用的方法包括理化分析方法和生物學(xué)測(cè)定方法。一般要使用動(dòng)物、細(xì)胞或生物分子，因此對(duì)于生物學(xué)測(cè)定的判斷標(biāo)準(zhǔn)可適當(dāng)靈活掌握對(duì)于定量測(cè)定方法應(yīng)盡可能減少方法的變異，驗(yàn)證的結(jié)果仍應(yīng)能證明該方法具有相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確性和可靠性，并應(yīng)以能夠有效控制產(chǎn)品質(zhì)量為基本標(biāo)準(zhǔn)。,5,二、 生物學(xué)測(cè)定常用方法,生物學(xué)測(cè)定系指采用生物學(xué)方法，以反映被測(cè)物的生物學(xué)特性為目的的測(cè)定方法。,6,（一）、酶反應(yīng)試驗(yàn) 是指在體外能促進(jìn)酶分子的活

3、化或本身具備酶的活性，通過底物的變化檢測(cè)酶活性。主要用于酶、輔酶、激酶、激活劑、抑制劑等的活性測(cè)定。這類方法的變異相對(duì)較小，結(jié)果比較準(zhǔn)確。,,7,,（二）、結(jié)合試驗(yàn) 是基于產(chǎn)品與某種物質(zhì)的結(jié)合特性而設(shè)計(jì)的試驗(yàn)，如免疫結(jié)合試驗(yàn)。目前主要用于生物制品的鑒別。由于在結(jié)合試驗(yàn)中測(cè)定的分子不一定都具有生物活性，所以一般不用作制品的活性（或效力）測(cè)定。這類方法的變異也相對(duì)較小。,8,,（三）、細(xì)胞測(cè)定試驗(yàn)

4、是指產(chǎn)品可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生可測(cè)定的應(yīng)答，如細(xì)胞增殖、聚集、分化、死亡、遷移或產(chǎn)生特定的化學(xué)物質(zhì)等。細(xì)胞測(cè)定試驗(yàn)一般能較好地反映制品的生物學(xué)活性，常用于各種生物制品的活性（效力）測(cè)定。與上述兩類方法相比，這類方法的變異較大。與使用傳代細(xì)胞相比，使用原代細(xì)胞的方法變異更大。,9,,（四）、動(dòng)物試驗(yàn) 是指以整體動(dòng)物為試驗(yàn)材料檢測(cè)制品生物學(xué)活性（或效力）的試驗(yàn)方法，如動(dòng)物保護(hù)力試驗(yàn)，一般用于疫苗的效力測(cè)定。由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的成本高

5、、周期長和變異大，所以一般僅用于成品檢定。對(duì)于某些治療用的制品，由于其作用機(jī)理或本身化學(xué)性質(zhì)的原因，難以建立體外測(cè)活的方法，也可以采用動(dòng)物試驗(yàn)方法測(cè)定，但由于這類方法的變異一般相對(duì)較大，在進(jìn)一步的研究中應(yīng)盡可能以體外法代替。,10,,鑒于一種測(cè)定方法僅能反映制品某一方面的特性，且方法的變異一般較大，為更好控制產(chǎn)品質(zhì)量，必要時(shí)需同時(shí)采用多種方法進(jìn)行測(cè)定。,11,三、方法的來源（種類）,根據(jù)質(zhì)控分析方法的來源，可將方法分為兩大類，即標(biāo)準(zhǔn)方法

6、和非標(biāo)準(zhǔn)方法。原則上，對(duì)于各類方法均需進(jìn)行驗(yàn)證，但依方法來源的不同對(duì)于驗(yàn)證的要求有所不同。,12,（一）、標(biāo)準(zhǔn)方法（或正式方法、法定方法） 一般是指已有國家標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)控方法，WHO推薦的質(zhì)控方法也可作為重要參考。此類方法在被確定為標(biāo)準(zhǔn)方法前已經(jīng)過了適當(dāng)?shù)尿?yàn)證。 采用此類方法前，也應(yīng)對(duì)該方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)尿?yàn)證,如進(jìn)行專屬性和精密度的驗(yàn)證，以便證明在實(shí)際的使用條件下該方法也是適用的。,13,（二）、非標(biāo)準(zhǔn)方法

7、 1、標(biāo)準(zhǔn)方法的替代方法 此類方法系指由申報(bào)者提出的可取代標(biāo)準(zhǔn)方法的替代方法。申報(bào)者在決定采用此類方法時(shí)應(yīng)持慎重的態(tài)度，并需提供表明新方法等同于或優(yōu)于原方法的依據(jù)以及全面的驗(yàn)證資料，包括兩種方法的比較性資料。,14,,2、來自參考文獻(xiàn)的方法 是指在專業(yè)雜志或著作上發(fā)表并介紹的方法，一般要認(rèn)真對(duì)待此類方法，并需進(jìn)行全面的驗(yàn)證。應(yīng)說明參考文獻(xiàn)的出處，附原文及譯文。,15,,3、自己建立的方

8、法 對(duì)于某些產(chǎn)品，尤其是創(chuàng)新性產(chǎn)品來講，由于缺少可參考的方法，通常需要自己建立一種新的分析方法，對(duì)于這類方法需進(jìn)行全面而嚴(yán)格的驗(yàn)證。,16,四、分析方法,生物藥品質(zhì)控分析方法的準(zhǔn)確性和可靠性與技術(shù)方法本身（包括方法的原理和方法的技術(shù)特點(diǎn)等）密切相關(guān)，一種系統(tǒng)的完整的分析方法應(yīng)包括：,17,（一）、分析方法的原理 （二）、供試品 應(yīng)說明如何取樣，包括每次測(cè)定時(shí)取樣的數(shù)量、如何取用（單支或多

9、支混合）等。 （三）、測(cè)試用儀器及參數(shù) （四）、測(cè)試用試劑 列出所有測(cè)試用的試劑和規(guī)格，并說明其來源。如果某些試劑為自制或?qū)Σ少彽脑噭┻M(jìn)行了加工處理，則應(yīng)詳述制備或處理過程。,,18,,（五）、標(biāo)準(zhǔn)品或參考品的配備 （六）、供試品的配備 ：（七）、測(cè)試過程 按實(shí)驗(yàn)步驟詳述整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，說明關(guān)鍵步驟的實(shí)驗(yàn)條件。 （八）、計(jì)算 盡可能以表格的形式顯示所獲取的數(shù)據(jù)，說明數(shù)

10、據(jù)的處理方法，提供計(jì)算公式，并說明計(jì)算方法的出處及采用依據(jù)。 （九）、結(jié)果報(bào)告 ：說明結(jié)果報(bào)告的形式 （十）、判定標(biāo)準(zhǔn)：提供判定標(biāo)準(zhǔn)，說明判定標(biāo)準(zhǔn)的制定依據(jù)。,19,五、分析方法的驗(yàn)證,質(zhì)控分析方法的驗(yàn)證就是根據(jù)方法的需要測(cè)定該方法的專屬性、準(zhǔn)確性、精密度、線性、范圍、檢測(cè)限度、定量限度、耐用性等幾個(gè)指標(biāo)中的一個(gè)或幾個(gè)，用于不同檢測(cè)目的的試驗(yàn)方法需進(jìn)行不同參數(shù)的測(cè)定，下表為各種檢測(cè)方法通常需測(cè)定的參數(shù)。,20,21,（一）專屬性,專

11、屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在下，采用的分析方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定被分析物質(zhì)的特性的能力。 通常鑒別、雜質(zhì)檢查、含量測(cè)定方法中均應(yīng)考察其專屬性。 如采用的方法不夠?qū)伲瑧?yīng)采用多個(gè)方法予以補(bǔ)充。,22,1、鑒別反應(yīng),專屬性試驗(yàn)要求證明能與可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似化合物區(qū)分，需確證含被分析物的樣品呈正反應(yīng)（可與已知對(duì)照物比較），而不含被測(cè)成分的樣品呈負(fù)反應(yīng)，以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，也應(yīng)呈

12、負(fù)反應(yīng)。,23,2、雜質(zhì)檢查,作為純度檢查，所采用的分析方法應(yīng)確保可檢出被分析物中雜質(zhì)的含量，如有關(guān)物質(zhì)、重金屬、殘留溶劑等。因此雜質(zhì)檢查要求分析方法有一定的專屬性。,24,雜質(zhì)可獲得: 可向供試品中加入一定量的雜質(zhì)，證明雜質(zhì)與共存物質(zhì)能得到分離和檢出，并具適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確度與精密度。雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得: 將供試品用強(qiáng)光照射，高溫，高濕，酸、堿水解及氧化的方法進(jìn)行破壞（制劑應(yīng)考慮輔料的影響），比較

13、破壞前后檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)和量。必要時(shí)可采用二極管陣列檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)，進(jìn)行色譜峰純度檢查。,25,3、含量測(cè)定,含量測(cè)定目的是得到樣品中被分析物的含量或效價(jià)的準(zhǔn)確結(jié)果。在雜質(zhì)可獲得的情況下，對(duì)于主成分含量測(cè)定可在供試品中加入雜質(zhì)或輔料，考察測(cè)定結(jié)果是否受干擾，并與未加雜質(zhì)和輔料的試樣比較測(cè)定結(jié)果。,26,在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可采用另一個(gè)經(jīng)驗(yàn)證了的或藥典方法進(jìn)行比較，比對(duì)兩種方法測(cè)定的結(jié)果。也可采用破壞性試驗(yàn)（強(qiáng)光照射，高溫，

14、高濕，酸、堿水解及氧化），得到含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣，用兩種方法進(jìn)行含量測(cè)定比較測(cè)定結(jié)果。必要時(shí)進(jìn)行色譜峰純度檢查，證明含量測(cè)定成分的色譜峰中不包含其他成分。,27,（二）準(zhǔn)確度,準(zhǔn)確度系指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或認(rèn)可的參考值之間接近的程度。有時(shí)也稱真實(shí)度。一般以回收率（％）表示。一定的準(zhǔn)確度為定量測(cè)定的必要條件，因此涉及到定量測(cè)定的檢測(cè)項(xiàng)目均需要驗(yàn)證準(zhǔn)確度，如含量測(cè)定、雜質(zhì)定量試驗(yàn)等。,28,準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)建立。該指標(biāo)

15、的驗(yàn)證一般以回收率試驗(yàn)來進(jìn)行，試驗(yàn)設(shè)計(jì)需考慮在規(guī)定范圍內(nèi)，制備3 個(gè)不同濃度的樣品，各測(cè)定3 次，即測(cè)定9 次，報(bào)告已知加入量的回收率（％）或測(cè)定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其可信限。,（二）準(zhǔn)確度,29,回收率,回收試驗(yàn)　可在幾份相同試樣中加入適量待測(cè)組分的純品，以相同條件進(jìn)行測(cè)定，按下式計(jì)算回收率： 回收率＝添加組分試樣測(cè)定值－原試樣測(cè)定值/組分添加量×１００％回收率越高則認(rèn)為方法越可靠。,30,1、含量測(cè)定

16、 原料藥可用已知純度的對(duì)照品或樣品進(jìn)行測(cè)定，或用本法所得結(jié)果與已建立準(zhǔn)確度的另一方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。 制劑可用含已知量被測(cè)物的各組分混合物進(jìn)行測(cè)定。,（二）準(zhǔn)確度,31,2、雜質(zhì)定量試驗(yàn) 雜質(zhì)的定量試驗(yàn)可向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。 如果不能得到雜質(zhì)或降解產(chǎn)物，可用本法測(cè)定結(jié)果與另一成熟的方法進(jìn)行比較，如藥典標(biāo)準(zhǔn)方法或經(jīng)過驗(yàn)證的方法。

17、 當(dāng)雜質(zhì)的光譜與主成分的光譜相似，則可采用原料藥的響應(yīng)因子近似計(jì)算雜質(zhì)含量（自身對(duì)照法）。并應(yīng)明確單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總量相當(dāng)于主成分的重量比（％）或是面積比（％）。,32,33,（三）精密度,精密度系指在規(guī)定的測(cè)試條件下，同一均質(zhì)樣品，經(jīng)多次取樣進(jìn)行一系列檢測(cè)所得結(jié)果之間的接近程度（離散程度）。 該指標(biāo)目的是考察分析方法在不同的時(shí)間、操作人員、試驗(yàn)室下，所得結(jié)果的重現(xiàn)性和重復(fù)性。涉及定量測(cè)定的項(xiàng)目考察

18、方法的精密度。,34,精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。取樣測(cè)定次數(shù)應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，至少用6次結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。 精密度可以從三個(gè)層次考察：重復(fù)性、中間精密度、重現(xiàn)性。,（三）精密度,35,1、重復(fù)性,重復(fù)性系指在同樣的操作條件下，在較短時(shí)間間隔內(nèi)，由一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度。重復(fù)性測(cè)定可在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用9 次測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，如制備3 個(gè)不同濃度的樣品，各測(cè)定3 次，或采用同一批樣品（把被測(cè)物

19、濃度當(dāng)作100％），用至少測(cè)定6 次的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。,36,2、中間精密度,中間精密度系指在同一試驗(yàn)室，由于試驗(yàn)室內(nèi)部條件改變，如時(shí)間、分析人員、儀器設(shè)備、測(cè)定結(jié)果的精密度。驗(yàn)證設(shè)計(jì)方案中的變動(dòng)因素一般為日期、分析人員、設(shè)備。,37,38,3、重現(xiàn)性,指不同實(shí)驗(yàn)室之間不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度。當(dāng)分析方法將被法定標(biāo)準(zhǔn)采用時(shí)，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)。,39,（四）線性,線性系指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果與試樣中被分析物的濃度（量）直接呈線性

20、比例關(guān)系的能力。 線性是定量測(cè)定的基礎(chǔ)，涉及定量測(cè)定的項(xiàng)目，如雜質(zhì)定量試驗(yàn)和含量測(cè)定均需要驗(yàn)證線性。做法: 可用一貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列被測(cè)物質(zhì)濃度系列進(jìn)行測(cè)定，至少制備5 個(gè)濃度。以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)作為被測(cè)物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性.,40,（五）范圍,范圍系指能夠達(dá)到一定的準(zhǔn)確度、精密度和線性，測(cè)試方法適用的試樣中被分析物的高低限濃度或量的區(qū)間。范圍通常用與分析方法的測(cè)試結(jié)

21、果相同的單位（如百分濃度）表達(dá)。涉及到定量測(cè)定的檢測(cè)項(xiàng)目均需要對(duì)范圍進(jìn)行驗(yàn)證，如含量測(cè)定、含量均勻度、溶出度或釋放度、雜質(zhì)定量試驗(yàn)等。,41,1、含量測(cè)定 范圍應(yīng)為測(cè)試濃度的80％～100％或更寬。2、雜質(zhì) 雜質(zhì)測(cè)定時(shí)，范圍應(yīng)根據(jù)初步實(shí)測(cè)，擬訂出規(guī)定限度的±20％。如果含量測(cè)定與雜質(zhì)檢查同時(shí)測(cè)定，用面積歸一化法，則線性范圍應(yīng)為雜質(zhì)規(guī)定限度的-20％至含量限度（或上限）的+20％。,（

22、五）范圍,42,（六）檢測(cè)限,檢測(cè)限系指試樣中的被分析物能夠被檢測(cè)到的最低量，但不一定要準(zhǔn)確定量。該驗(yàn)證指標(biāo)的意義在于考察方法是否具備靈敏的檢測(cè)能力。因此對(duì)雜質(zhì)限度試驗(yàn)，需證明方法具有足夠低的檢測(cè)限，以保證需要控制的雜質(zhì)被測(cè)出。,43,1、直觀法 直觀評(píng)價(jià)可以用于非儀器分析方法，也可用于儀器分析方法。 檢測(cè)限的測(cè)定是通過對(duì)一系列已知濃度被分析物的樣品進(jìn)行分析，并以能準(zhǔn)確（或被可靠）地檢測(cè)被測(cè)物的最

23、小量或最低濃度來建立。,（六）檢測(cè)限,44,2、信噪比法 用于能顯示基線噪音的分析方法，即把已知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，算出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。一般以信噪比為3：1 或2：1 時(shí)相應(yīng)的濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限。 其他方法有基于工作曲線的斜率和響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行計(jì)算的方法等。,（六）檢測(cè)限,45,（七）定量限,定量限系指試樣中的被分析物能夠被定量測(cè)定的最低量，其

24、測(cè)定結(jié)果應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確度和精密度。 常用信噪比法確定定量限。一般以信噪比為10：1 時(shí)相應(yīng)的濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定。,46,1、直觀法 直觀評(píng)價(jià)可以用于非儀器分析方法，也可用于儀器分析方法。定量限一般通過對(duì)一系列含有已知濃度被測(cè)物的樣品進(jìn)行分析，在準(zhǔn)確度和精密度都符合要求的情況下，來確定被測(cè)物能被定量的最小量。,（七）定量限,47,2、信噪比法 用于能顯示基線噪音的分析方

25、法，即把已知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，算出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。一般可接受的信噪比是10：1。,（七）定量限,48,（八）耐用性,耐用性系指測(cè)定條件發(fā)生細(xì)小變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果保持不受影響的承受程度。耐用性主要考察方法本身對(duì)于可變?cè)囼?yàn)因素的抗干擾能力。開始研究分析方法時(shí)，就應(yīng)考慮其耐用性。如果測(cè)試條件要求苛刻，則建議在方法中予以寫明。,49,典型的變動(dòng)因素包括： 液相色譜法中流動(dòng)相的

26、組成和pH 值，不同廠牌或不同批號(hào)的同類型色譜柱，柱溫、流速等。氣相色譜法中載氣及流速、不同廠牌或批號(hào)的色譜柱、固定相，擔(dān)體、柱溫，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度等。經(jīng)試驗(yàn)，應(yīng)說明小的變動(dòng)能否通過設(shè)計(jì)的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，以確保方法有效。,（八）耐用性,50,(九）系統(tǒng)適用性試驗(yàn),對(duì)一些儀器測(cè)試方法，在進(jìn)行方法驗(yàn)證時(shí)，有必要將分析設(shè)備、電子儀器與實(shí)驗(yàn)操作、被測(cè)試樣品等一起當(dāng)作完整的系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估。系統(tǒng)適用性是對(duì)整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估的指標(biāo)。,51,六、綜合分

27、析,1、有關(guān)方法驗(yàn)證評(píng)價(jià)的一般考慮 總體上，方法驗(yàn)證應(yīng)圍繞驗(yàn)證目的和一般原則來進(jìn)行，方法驗(yàn)證內(nèi)容的選擇和試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案應(yīng)合理、充分，驗(yàn)證過程應(yīng)規(guī)范嚴(yán)謹(jǐn)。并非每個(gè)分析方法都要進(jìn)行所有內(nèi)容的驗(yàn)證。 如雜質(zhì)的限度,試驗(yàn)分析方法一般需要驗(yàn)證專屬性和檢測(cè)限，而對(duì)于精密度、線性、定量限等涉及定量測(cè)定的項(xiàng)目，則一般不需要進(jìn)行驗(yàn)證。,52,2、方法驗(yàn)證的整體性、系統(tǒng)性和靈活性. 方法驗(yàn)證內(nèi)容之間相互關(guān)聯(lián)，是一個(gè)整體。

28、 例如，對(duì)于鑒別項(xiàng)目所需要的專屬性，一般一種分析方法不太可能完全鑒別被分析物，此時(shí)采用兩種或兩種以上分析方法可加強(qiáng)鑒別項(xiàng)目的整體專屬性。,53,方法驗(yàn)證指標(biāo)之間存在較多的關(guān)聯(lián)性，可以相互補(bǔ)充。 如原料藥含量測(cè)定采用容量滴定法時(shí)，專屬性略差，但假如在雜質(zhì)檢測(cè)時(shí)采用了專屬性較強(qiáng)的色譜法，則一般認(rèn)為整個(gè)檢測(cè)方法也具有較強(qiáng)的專屬性。 總之，由于實(shí)際情況較復(fù)雜，在方法驗(yàn)證過程中，具體情況應(yīng)具體分析，不提