臨床免疫學(xué)檢驗的質(zhì)量保證

1、臨床免疫學(xué)檢驗（ Clinical Immunoassay）,昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)教研室 田 敏 (Min Tian),第十九章 臨床免疫學(xué)檢驗的質(zhì)量保證,第一節(jié) 分析前質(zhì)量控制 第二節(jié) 分析中質(zhì)量控制 第三節(jié) 分析后質(zhì)量控制,目的要求,掌握免疫學(xué)檢驗質(zhì)量控制的有關(guān)概念及質(zhì)量控制原則掌握標(biāo)本的正確收集及處理熟悉常用免疫學(xué)檢驗的質(zhì)量控制、室間

2、質(zhì)量評價了解質(zhì)量保證、室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)量評價之間的關(guān)系，免疫學(xué)質(zhì)量控制的意義,免疫學(xué)檢驗質(zhì)量控制的有關(guān)概念,1．質(zhì)量保證（quality assurance，QA）2．室內(nèi)質(zhì)量控制(internal quality control，IQC) 3．室間質(zhì)量評價(external quality assessment，EQA),免疫學(xué)檢驗質(zhì)量控制的有關(guān)概念,4．準(zhǔn)確度（accuracy） 5．精密度(precisi

3、on) 6．標(biāo)準(zhǔn)品（standard character）7．質(zhì)控物(質(zhì)控品，quality testing materials),質(zhì)量保證：為一產(chǎn)品或服務(wù)項目、為滿足特定的質(zhì)量要求而提供的具有充分可信性所進(jìn)行的、有計劃和系統(tǒng)的措施,室內(nèi)質(zhì)量控制：由實驗室工作人員采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價本實驗室工作的可靠程度目的是監(jiān)測和控制本室常規(guī)工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗的一致性，以確定測定結(jié)果是否可靠、可否發(fā)

4、出報告的一項工作,室間質(zhì)量評價：為客觀比較一實驗室的測定結(jié)果與靶值的差異，由外單位機(jī)構(gòu)采取一定的方法，連續(xù)、客觀地評價實驗室的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)誤差并校正結(jié)果，使各實驗室之間的結(jié)果具有可比性這是對實驗室操作和實驗方法的回顧性評價，而不是用來決定實時的測定結(jié)果的可接受性,準(zhǔn)確度：即待測物的測定值與其真值的一致性程度準(zhǔn)確度不能直接以數(shù)值表示，通常以不準(zhǔn)確度來間接衡量對一分析物重復(fù)多次測定，所得均值與其真值或參考靶值之間的差異亦即偏差，即為

5、測定的不準(zhǔn)確度,精密度：在一定條件下所獲得的獨立的測定結(jié)果之間的一致性程度與準(zhǔn)確度一樣，精密度同樣也是以不精密度來間接表示測定不精密度的主要來源是隨機(jī)誤差，以標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和/或變異系數(shù)（CV）具體表示SD或CV越大，表示重復(fù)測定的離散度越大，精密度越差，反之則越好,標(biāo)準(zhǔn)品(物)：指性質(zhì)純正的己知含量或成分的物質(zhì)，通常用以比較檢測未知的物質(zhì)或成分標(biāo)準(zhǔn)品有WHO國際標(biāo)準(zhǔn)品和國家標(biāo)準(zhǔn)品,質(zhì)控物(品)：是用以校準(zhǔn)物相同的介質(zhì)制備

6、的，具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性其作用主要是控制儀器的穩(wěn)定性，以保證儀器、試劑、工作環(huán)境具高度的穩(wěn)定性,第一節(jié) 分析前質(zhì)量控制,一、檢驗項目的申請二、患者準(zhǔn)備三、標(biāo)本的采集、傳送與保存四、影響分析前質(zhì)量的因素,概述,分析前程序，也稱為檢驗前程序，按時間順序，檢驗前程序始于臨床醫(yī)師提出申請，止于啟動分析檢驗程序。其步驟包括檢驗申請、患者準(zhǔn)備、原始樣品采集、樣本轉(zhuǎn)運到實驗室、在實驗室內(nèi)部傳遞及檢驗前標(biāo)本的預(yù)處理的全部過程。,一、檢驗項

7、目的申請,要求：信息的規(guī)范性和完整性形式：電子、紙質(zhì)、二者兼有或者口頭（必須在規(guī)定時間內(nèi)補充電子或紙質(zhì)的才能執(zhí)行）（一）申請單格式和填寫（二）檢驗項目的申請原則,（一）申請單格式和填寫,患者信息：患者姓名、患者性別及年齡、臨床診斷、患者唯一性標(biāo)示（住院號、門診號、病案號等）申請醫(yī)師信息：醫(yī)師姓名、科室、申請時間原始樣本信息：血液、尿液、腦脊液、胸腹水等,（二）檢驗項目的申請原則,應(yīng)結(jié)合患者的病情選擇適合的檢驗項目1.針對性:

8、 檢測指標(biāo)要符合臨床醫(yī)師的檢測目的2.有效性: 對診斷疾病的敏感性和特異性3.時效性: 結(jié)果回報的及時性4.經(jīng)濟(jì)性: 避免增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),二、患者準(zhǔn)備,醫(yī)護(hù)人員、樣本采集人員、檢驗技術(shù)人員應(yīng)了解采集前患者的狀態(tài)要求和影響結(jié)果的非疾病因素將相關(guān)的要求和注意事項通過合適的途徑告知患者，以獲得患者的配合保證所采集標(biāo)本能客觀真實反映當(dāng)前的疾病狀態(tài),三、標(biāo)本的采集、傳送與保存,標(biāo)本的采集：可用作ELISA的標(biāo)本十分廣泛，體液（

9、如血清，血漿，各種積液），分泌物（如唾液）和排瀉物（如糞便，尿液）均可作為標(biāo)本以測定其中的抗原或抗體成分，一般使用血清?！驑?biāo)本采集時應(yīng)盡量避免溶血，因紅細(xì)胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質(zhì)干擾結(jié)果，可造成假陽性；◎長菌的標(biāo)本同樣的道理易產(chǎn)生假陽性。,標(biāo)本的采集,◎抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝劑?！驑?biāo)本在冰箱中保存時間過長易導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深，一般血清置4℃冰

10、箱5天內(nèi)完成測試。如需保存一周以上則要-20℃冰凍保存，融解時應(yīng)上下顛倒充分混勻，同時避免氣泡?！駿LISA的靈敏度>1ng/ml水平上,標(biāo)本間的污染要盡量避免，尤其不應(yīng)與生化試驗用同一管標(biāo)本.最起碼應(yīng)先做免疫后做生化。,標(biāo)本的采集,采樣時間：晨起空腹 激素和治療藥物測定,三、標(biāo)本的采集、傳送與保存,傳送與保存： 標(biāo)本的傳送過程中應(yīng)保證標(biāo)本的密閉、防震、防漏、防污染。

11、,四、影響分析前質(zhì)量的因素,檢驗前影響因素具有：復(fù)雜性隱蔽性不可控性責(zé)任不確定性,第二節(jié) 分析中質(zhì)量控制,分析中階段是指從標(biāo)本前處理到標(biāo)本檢測完成，形成報告結(jié)果的過程包括標(biāo)本前處理、標(biāo)本檢測還應(yīng)包括檢測體系的建立、人員培訓(xùn)、檢測系統(tǒng)的選擇和性能確認(rèn)、室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量控制、實驗室間比對等內(nèi)容分析中階段是決定檢驗結(jié)果正確、可靠的關(guān)鍵,工作人員培訓(xùn),特點：項目廣泛，技術(shù)眾多，既有手工操作，又有自動化儀器操作根據(jù)實際工作

12、需要，建立定期培訓(xùn)計劃，保證工作人員的技術(shù)能滿足臨床免疫檢驗的需求,工作人員培訓(xùn),◎ 熟悉檢測儀器的原理及性能；掌握數(shù)據(jù)處理的能力和質(zhì)量控制知識?！蚰承┨厥忭椖康臋z測如抗HIV等需經(jīng)有關(guān)部門組織的專門培訓(xùn)班，考試合格后持證上崗。,檢驗系統(tǒng)性能確認(rèn),定量檢測系統(tǒng)：精密度（批內(nèi)、批間）準(zhǔn)確度分析測量范圍臨床可報告范圍參考期間驗證,定性檢測系統(tǒng),符合率（靈敏度 特異度）驗證精密度（批內(nèi)精密度 批間精密度，即中間精密度）

13、驗證檢出限驗證臨界值（cut-off值）驗證,方法學(xué)性能驗證,實驗方案 實驗計劃 實驗實施 實驗報告,標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的建立,在免疫測定中，試劑準(zhǔn)備、加樣、溫育、洗板、顯色和測定等每一步驟均可能對測定結(jié)果產(chǎn)生較大影響因此，需要將每個操作步驟標(biāo)準(zhǔn)化并形成“標(biāo)準(zhǔn)操作程

14、序”（SOP），所有操作人員必須按照SOP進(jìn)行試驗操作,加樣,◎在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。◎加樣應(yīng)用微量移液器（加樣槍)按規(guī)定的量加入微孔板的1/3處避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡?！蛎看渭訕討?yīng)更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染;干吸頭預(yù)先在血清中抽吸三次。,加樣,◎樣本稀釋，目的是為了減少非特異性反應(yīng)，所以一定要先加稀釋液后加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩

15、30秒鐘，同時注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時均需振蕩混勻?！蛉缬玫纹康渭釉噭?yīng)先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣。,ELISA競爭法的本質(zhì)：酶標(biāo)抗體與樣本抗體在同樣體系中，與固相抗原競爭結(jié)合是等比例關(guān)系。正確的加樣：應(yīng)該先將樣本與酶標(biāo)抗體混合均勻，然后加入孔中反應(yīng)。實際工作中,,,分開加,分開加會造成先加入的先結(jié)合，與后加入者并不是公平競爭關(guān)系，也不符合等比例原則。特別是在放置時間過長，溫度過高的情況

16、下，對結(jié)果的影響很大。有研究表明，2min后加入酶標(biāo)抗體，由于標(biāo)本比酶標(biāo)抗體先結(jié)合了2min，因此可出現(xiàn)7.4%的假陽性。30min后再加，假陽性率高達(dá)57.4%。,溫育,在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后的顯色反應(yīng)。溫育常采用的溫度有43 ℃、37 ℃、室溫和4 ℃（冰箱溫度）等。37 ℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。,洗滌,洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決

17、定著實驗的成敗。ELISA是靠洗滌來達(dá)到分離結(jié)合與未結(jié)合抗原抗體復(fù)合物及酶標(biāo)記物的目的。同時洗滌也可將非特異吸附的蛋白質(zhì)的干擾以及血球、細(xì)菌中的酶干擾清除掉。,顯色和比色,◎HRP催化底物的一步呈色反應(yīng)，同樣需要一定的時間和溫度?！?一定要按照說明書規(guī)定的時間溫度（一般為37°C，10-15分鐘）恒定反應(yīng)后終止。◎顯色反應(yīng)終止后應(yīng)立刻比色（30分鐘內(nèi)）。,報告方式,定性試驗 國內(nèi)外為便于統(tǒng)一計算，一律按S/C.O方式報

18、告，S為標(biāo)本A值，C.O即Cut Off值（陽性判定值)◎夾心法和間接法以S/C.O≥1為陽性；◎竟?fàn)幏ㄅc中和法以S/C.O﹤1為陽性,室內(nèi)質(zhì)量控制,定量室內(nèi)質(zhì)量控制：L-J質(zhì)量控制圖定性室內(nèi)質(zhì)量控制,定性室內(nèi)質(zhì)量控制,定性試驗的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關(guān)，因此QC要保證：控制提供反應(yīng)的儀器/系統(tǒng)的穩(wěn)定性（靈敏度和特異性）。檢出假陽性反應(yīng)和假陰性反應(yīng)（即符合率和一致性）。（保證檢測結(jié)果陽性就是陽性、陰性就是

19、陰性）HOOK效應(yīng)的監(jiān)控。,質(zhì)控物的選擇：質(zhì)控物來源：均采用自制質(zhì)控物質(zhì)。濃度梯度的設(shè)置：（1）陰性質(zhì)控：0.5倍Cut Off值附近的陰性O(shè)D值（2）陽性質(zhì)控： ?弱陽性質(zhì)控：2-4倍Cut Off值附近的弱陽性O(shè)D值 ?陽性質(zhì)控：試劑盒所帶陽性對照OD值,控制提供反應(yīng)的儀器/系統(tǒng)的穩(wěn)定性,建議采用弱陽性質(zhì)控物作Levey-Jennings質(zhì)控圖，橫坐標(biāo)（X軸）表明的是檢測日期，縱坐標(biāo)（Y軸）用吸光度值表示。旨在監(jiān)測和

20、控制本室常規(guī)工作的精密度、靈敏度，提高批內(nèi)批間樣本檢驗的一致性,檢出假陽性反應(yīng)和假陰性反應(yīng),建議采用Westgard質(zhì)控規(guī)則改良法對第三方陰性、弱陽性質(zhì)控進(jìn)行分析 繪制中心線和上下失控限三條線，中心線為質(zhì)控物測量均值，利用臨界值（cut off值）驗證值確定上下失控限。,監(jiān)控HOOK效應(yīng),建議采用試劑盒中試劑盒所帶質(zhì)控（陽性對照）的OD值作Levey-Jennings質(zhì)控圖來監(jiān)控，橫坐標(biāo)（X軸）表明的是檢測日期，縱坐標(biāo)（Y軸）用

21、吸光度值表示。判斷：當(dāng)?shù)谌劫|(zhì)控（陰性、弱陽性）均在控時，試劑盒所帶質(zhì)控（陽性對照）下限超限，此時，應(yīng)考慮HOOK效應(yīng)的發(fā)生,HOOK效應(yīng)處理對策,當(dāng)監(jiān)控到HOOK效應(yīng)的發(fā)生時，應(yīng)在LIS系統(tǒng)上回顧病人結(jié)果，對可疑結(jié)果、陽性低值結(jié)果、在cut-off值附近的結(jié)果采用同步稀釋法進(jìn)行重復(fù)試驗,室間質(zhì)量控制,室間質(zhì)量評價：為客觀比較一實驗室的測定結(jié)果與靶值的差異，由外單位機(jī)構(gòu)采取一定的方法，連續(xù)、客觀地評價實驗室的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)誤差并校正結(jié)

22、果，使各實驗室之間的結(jié)果具有可比性這是對實驗室操作和實驗方法的回顧性評價，而不是用來決定實時的測定結(jié)果的可接受性,室間質(zhì)量控制,室間質(zhì)量控制實施途徑：室間質(zhì)量控制可通過能力驗證實驗（簡稱PT）來實現(xiàn)PT是指多家實驗室分析同一標(biāo)本并由外部獨立機(jī)構(gòu)收集、反饋實驗室上報結(jié)果并評價實驗室檢測能力的活動國家級PT計劃，由衛(wèi)生部臨檢中心組織實施省級PT計劃，有省臨檢中心組織實施,實驗室間比對和人員比對,實驗室間比對是按照預(yù)先規(guī)定的條件，由

23、兩個或多個實驗室對相同或類似檢測物品（通常是患者新鮮標(biāo)本）進(jìn)行檢測（主要針對一些不能參加室間質(zhì)量控制的項目）人員比對是指實驗室為發(fā)現(xiàn)及糾正不同工作人員從事相同檢測項目而導(dǎo)致檢測結(jié)果存在可接受的偏倚而采取的措施,實驗室環(huán)境、設(shè)施及設(shè)備的控制,環(huán)境： 室溫： 18℃----25 ℃ 濕度：30%---60%設(shè)施及設(shè)備: 輔助設(shè)備及儀器 包括移液器（加樣槍），水

24、浴箱（溫箱），洗板機(jī)和酶標(biāo)儀。,輔助設(shè)備及儀器,◎移液器：ELISA加樣量?。?-100ｕl），其準(zhǔn)確性直接影響實驗結(jié)果，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準(zhǔn)確，一般應(yīng)在±10%以內(nèi)；◎水浴箱 經(jīng)常檢查水浴箱溫度計所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實測溫度是否一致，允許有±1℃的誤差；,輔助設(shè)備及儀器,◎洗板機(jī) 每個廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過3ul ，人工扣板時，墊紙不濕

25、，定期檢查管孔是否堵塞；◎酶標(biāo)儀 經(jīng)常維護(hù)其光學(xué)部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。,第三節(jié) 分析后質(zhì)量控制,一、檢驗結(jié)果的審核和發(fā)放二、檢驗后標(biāo)本的保存與處理三、咨詢服務(wù),一、檢驗結(jié)果的審核和發(fā)放,報告的審核和發(fā)放制度： 實驗室應(yīng)制定報告審核和發(fā)放制度，審核應(yīng)由相應(yīng)資格的工作人員進(jìn)行：信息的規(guī)范性和完整性（檢測項目是否完整、結(jié)果格式是否正確、報告內(nèi)容是否正確、檢測過程中室內(nèi)質(zhì)控是否在控等）,報告

26、的審核和發(fā)放制度,根據(jù)提供的臨床診斷信息，評估檢測結(jié)果與患者病情的符合性遇到懷疑或明顯不符合的情況，應(yīng)對本次結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，或通過及時與臨床醫(yī)護(hù)、患者溝通獲得更多相關(guān)信息,二、檢驗后標(biāo)本的保存與處理,檢驗后標(biāo)本的保存：為了必要的復(fù)查，依據(jù)檢測的需求，對檢測后的標(biāo)本按規(guī)定的保存時間和方法進(jìn)行保存（如HBV、HCV、TP、HIV等原始標(biāo)本管4 ℃ 冰箱保存3月后送微生物室高壓滅菌后統(tǒng)一銷毀處理，并做好相關(guān)記錄）對于一些需長期保存的標(biāo)本，

27、應(yīng)對分析物穩(wěn)定性的影響進(jìn)行確認(rèn)，必要時分離血清，血漿、細(xì)胞成分進(jìn)行保存,二、檢驗后標(biāo)本的保存與處理,檢驗后標(biāo)本的處理：檢驗后標(biāo)本的處理應(yīng)根據(jù)有關(guān)法律法規(guī)對二級生物實驗室的要求，按照潛在生物危害處理方式進(jìn)行處理,三、咨詢服務(wù),咨詢服務(wù)的提供：實驗室應(yīng)主動為患者和臨床醫(yī)護(hù)提供檢驗結(jié)果的解釋和咨詢服務(wù)，以便使檢驗結(jié)果在診斷、治療中發(fā)揮更大作用。對檢測系統(tǒng)、疾病的自然發(fā)展過程、標(biāo)本的質(zhì)量等因素造成檢測結(jié)果的影響做出解釋。對于參考范圍、臨