免疫學技術免疫血清制備

1、抗體制備,,一、免疫動物,動物選擇：種類多。哺乳類或禽類。選擇適齡、健壯的動物原則：需要血清量、抗原從何種種屬動物分離獲得，需要單抗時，有多少抗原可使用。常用種類：兔、小鼠、大鼠、豚鼠、中國倉鼠商品用動物：豬、馬、牛、羊多抗制備常用兔（得到500ml血清?。?多克隆抗體制備,動物選擇,,動物 血清最大量 單抗可能性 純系 評價,,兔

2、 500 有可能 否 常用于多抗制備小鼠 2 是 是 常用單抗制備大鼠 20 是

3、 是 生產(chǎn)單抗中國倉鼠 20 否 否 抗原少時生產(chǎn)多抗豚鼠 30 否 否 難以采血雞

4、 50 否 否 對高度保守的哺乳動 物抗原較好,,小鼠6周左右成熟，大鼠6-8周，兔12周成熟數(shù)量：小鼠3-5只，兔最少兩只,抗原及抗原劑量的選擇：所

5、用抗原應具備抗原特異性和較高的純度。而且可被降解抗原劑量根據(jù)其種類、免疫次數(shù)、注射途徑及動物種類、免疫周期等不同?？乖瓌┝窟^低或過高均不能誘導產(chǎn)生抗體在一定范圍內(nèi)，抗體效價隨注射抗原劑量而增高,二、抗原,抗原溶液最好為中性生理學緩沖液（如PBS）從丙烯酰胺凝膠中純化抗原：電泳后蛋白定位、制備凝膠碎片（對于大動物）、電洗脫凝膠、轉(zhuǎn)膜（硝酸纖維素膜）后超聲半抗原：交聯(lián)載體（BSA，KLH，藍載體）多肽抗原：肽長度、合成難度，肽的

6、活動性。最安全的選擇是制備多個不同區(qū)域的10-15個氨基酸的合成肽。偶聯(lián)策略,小鼠：首次50-100ug/次；大鼠：100ug-1mg/次，兔0.5-1mg/次加強免疫的劑量為首次劑量的1/5-2/5高度特異性抗血清：策略為低劑量抗原短程免疫法高效價的抗血清：策略為大劑量抗原長程免疫法。,三、佐劑的應用,顆粒性抗原或全細胞抗原不需要佐劑可溶性抗原須用佐劑，以增強抗原的免疫原性或改變免疫反應的類型，刺激機體產(chǎn)生較強的免疫應答

7、佐劑種類：弗氏（Freund’s）佐劑、脂質(zhì)體佐劑、氫氧化鋁佐劑，SAF-1和RASIFA：羊毛脂1份，石蠟油5份，每毫升IFA中加入1-20mg卡介苗即為CFA。,四、注射途徑,兔：較大體積注射采用多點皮下小鼠：大體積顆粒性抗原通過腹腔注射、皮下注射（含佐劑可溶性抗原），靜脈注射不適于顆粒性抗原或含佐劑。緩慢釋放抗原：肌肉或皮下注射、皮下注射立即釋放抗原：靜脈注射（常在強化免疫時用）靜脈注射防止發(fā)生過敏性休克含佐劑的抗原

8、不可只在一點注射,五、加強免疫,兔：3-6周注射一次，避免每兩周加強免疫，持續(xù)使動物暴露于免疫原，循環(huán)抗體降低加強免疫效應小鼠：2-3周加強免疫一次,用于小鼠的免疫原推薦劑量、免疫方式,,抗原類型 例子 基礎或加強免疫 終加強免疫 途徑 劑量 佐劑

9、 途徑 劑量 佐劑,,,,可溶性蛋白 酶等 ip,sc 5-50ug + iv 5-50ug -顆粒性蛋白 病毒、細菌 ip,sc 5-50ug + iv 5-50ug -不溶性蛋白 包涵體等 ip,sc 5-50ug + iv 5-5

10、0ug -活細胞 ip 105-107 - iv 106 -活瘤細胞 ip 104-106 - iv 106 -碳水化合物

11、 ip 10-50ug iv 10-50ug -,,六、免疫效果評價,檢測免疫血清以免疫前血清作為陰性對照鑒定抗體特異性、效價、交叉反應性。方法：ELISA，Western Blot等,單克隆抗體制備,七、抗體純化,硫酸銨沉淀法：簡易價廉、濃度高，但純度不高辛酸沉淀法：純化IgG類抗體，價廉，但純度不高DEAE柱層析法：起始抗體PH只高于抗體等電點，抗

12、體與DEAE結合，用離子強度逐漸增強的緩沖液洗脫。蛋白A、蛋白G柱純化抗體免疫親和層析：從多克隆血清中純化特異性抗體方法,,,免疫親和層析法：（1）用抗原免疫親和柱純化：對多克隆血清，純化特異性抗體唯一方法（2）用抗Ig免疫親和柱純化抗體：分離大鼠單克隆抗體,八、抗體的保存,血清、組織或培養(yǎng)上清、腹水保存：0.02%NaN3;分裝保存純化抗體保存：PH值調(diào)整，PBS或其他等滲溶液，濃度不宜過低，如果不用于標記可在低濃度抗體中加