免疫學(xué)原理與技術(shù)答辯

1、靶向Del-1蛋白的腫瘤血管阻斷劑與新生血管抑制劑雙效抗體藥物的制備,,龍益如,王慧,指導(dǎo)老師,,答辯人,,,,編輯標題,團隊成員,,,,,,Part 1,Part 2,Part 3,,研究思路與方法,緒 論,應(yīng)用前景,目錄,Contents,,,,緒 論,Part 1,,,,選題背景,相關(guān)研究狀況,研究意義,1.1 選題背景,,,Del-1（developmental?endothelial? locus-1）最早被發(fā)現(xiàn)是

2、一種在胚胎血管生成過程中由內(nèi)皮細胞分泌的ECM蛋白，具有促進血管形成的作用，是一種重要的血管再生因子和免疫調(diào)節(jié)因子。,,,,1.1 選題背景,,,,,,Del-1蛋白含有三個重復(fù)表皮生長因子EGF樣結(jié)構(gòu)域和兩個盤狀結(jié)構(gòu)樣結(jié)構(gòu)域。其第二個EGF結(jié)構(gòu)域（EGF2）包含一個可結(jié)合整合素的重要模體，RGD模體（Arg-Gly-Asp），兩個盤狀結(jié)構(gòu)域則可結(jié)合磷脂酰絲氨酸，特殊的結(jié)構(gòu)決定了Del-1在細胞微環(huán)境中發(fā)揮的功能。,1.Del-1促腫瘤

3、血管生成作用,,,結(jié)合αvβ3,,2.Del-1促進腫瘤生長及轉(zhuǎn)移,1.3 研究意義,,,學(xué)術(shù)研究意義,Del-1作為腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中重要的胞外基質(zhì)蛋白，抗Del-1蛋白抗體藥物的制備，將為該靶點的實際應(yīng)用提供相應(yīng)方法，也對腫瘤微環(huán)境中其他靶點的研究提供參考。,,,社會效益,可用于治療肝癌、胰腺癌、肺癌、大腸癌等癌癥腫瘤，為惡性腫瘤治療提供新的選擇，幫助病人減輕病痛，提高其生活質(zhì)量。,,,經(jīng)濟效益,制成制備相應(yīng)抗體藥物可用于腫瘤檢測和

4、治療，將會有很大經(jīng)濟效益。,,,,01,,,,,02,03,,,研究思路與方法,Part 2,,,,理論依據(jù),研究思路,可行性說明,,2.1 理論依據(jù),,,,,3,個依據(jù),研究的三個理論依據(jù),,,,,,,理論依據(jù)一,理論依據(jù)二,理論依據(jù)三,Del-1蛋白在腫瘤微環(huán)境中高表達，在正常人組織器官中僅部分部位表達如眼等。Del-1蛋白在腫瘤新生血管生成、抗腫瘤血管內(nèi)皮細胞凋亡以及腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等多信號通路中發(fā)揮重要作用。,凝血酶原在凝血機制中

5、起到中心作用，且其轉(zhuǎn)化為凝血酶之后才具有相應(yīng)活性，而凝血酶原和Del-1蛋白在與整合素結(jié)合均依賴RGD模體，可能存在共同抗原。,單克隆抗體的制備技術(shù)和小分子抗體制備方法為我們提供了技術(shù)手段。,思路,A,B,C,D,E,兵馬未動糧草先行,切斷運糧通道,Del-1蛋白靶點,抗體導(dǎo)彈,親和力、凝血酶原,2.2 研究思路,,DEL-1蛋白的3D構(gòu)型,2.2.1 Del-1相關(guān)情況,2.2.1 Del-1相關(guān)情況,分子量及其特征,Del-1蛋白的

6、序列展示,2.2.1 Del-1相關(guān)情況,Del-1蛋白中EGF-2的結(jié)構(gòu)域放大,2.2.1 Del-1相關(guān)情況,實驗所用具體材料,2.2.1 Del-1相關(guān)情況,材料,動物免疫,飼養(yǎng)細胞的制備,瘤細胞SP2/0的制備,免疫脾細胞的制備,細胞融合,陽性雜交瘤細胞的篩選和克隆,細胞凍存與復(fù)蘇,單抗腹水的制備及效價的測定,1,2,3,4,5,6,7,9,8,2.2.2 抗Del-1蛋白的單克隆抗體的制備,培養(yǎng)基及血清：胎牛血清、RPMI 1

7、640培養(yǎng)基；試劑：HT、HAT、PEG3500、CFA、IFA、DMSO；細胞系：骨髓瘤細胞系 SP2/0 本校實驗室保存；Balb/ C 小鼠若干；,2.2.2 抗Del-1蛋白的單克隆抗體的制備,一、假設(shè)小分子抗體與凝血酶原能夠結(jié)合,腫瘤細胞,Del-1,血管,,Del-1抗體,,凝血酶原,2.2.3 篩選滿足親和力條件的抗體,酶免疫技術(shù)法（ELISA）：（1）將單位量Del-1蛋白吸附于固相載體上，洗滌，封阻。（2）

8、用辣根過氧化物酶（HRP）根據(jù)過碘酸鹽氧化交聯(lián)法進行抗體標記,將酶標抗體加入孔內(nèi)。（3）洗滌未反應(yīng)物。（4）加入底物（TMB）。（5）加入濃硫酸終止反應(yīng)，測OD值，檢測顯色反應(yīng)的程度，記錄。（6）加入第二種抗體（單位量），重復(fù)前面步驟，直至全部檢測完。（7）根據(jù)顯色程度大小，將抗體按與Del-1親和力的大小進行排序。,2.2.3 篩選滿足親和力條件的抗體,,酶免疫技術(shù)法（ELISA）:排序后，按親和力從大到小的順序，同理用EL

9、ISA將抗體與凝血酶原反應(yīng)，檢測反應(yīng)親和力，并與上面步驟進行比較，直至篩選出滿足“抗體—Del-1親和力大于抗體—凝血酶原親和力”的抗體。,篩選滿足親和力條件的抗體,2.2.3 篩選滿足親和力條件的抗體,2.2.4 凝血酶原修飾連接,采用流式細胞儀確定抗原—抗體結(jié)合表位。然后利用基因拼接技術(shù)（基因工程），在融合蛋白作用下，將表位與酶原連接，這樣就可保證抗體與酶原結(jié)合。,,基因工程,凝血酶原可視為載體，篩選得到的抗原表位視為半抗原，用碳化

10、二亞胺法將兩者連接，測偶聯(lián)比。最后用ELISA找到想要的偶聯(lián)物。,,蛋白質(zhì)工程,當抗體不滿足親和力條件時,采用脂質(zhì)體包埋法，將脂質(zhì)體包埋在酶原上，制成多囊顆粒。增加酶原穩(wěn)定性。,,酶固定化法,根據(jù)腫瘤細胞特有的Warburg反應(yīng)，可將PKM2結(jié)合蛋白結(jié)合在酶原上，待其進入腫瘤微環(huán)境后可被特異性結(jié)合、酶解，而不破壞酶原。,,能量底物法,對于酶原在機體的保護,2.2.5 測小分子抗體的效價、親和力、特異性,,3,④-70℃保存,①將交聯(lián)劑P

11、MPI粉末溶于DMSO，CA4P，再加入PBS緩沖液，按一定物料比，分批加入，輕輕攪拌，反應(yīng)數(shù)小時,③將還原性抗體與PMPI-CA4P按一定比例偶聯(lián)瓊葡糖凝膠脫鹽,②將抗體與還原劑TCEP以一定比例混合攪勻，反應(yīng)1h后，超濾除鹽,,,,,,,,2.2.5 偶聯(lián)物純化，偶聯(lián)比檢測方法,一、偶聯(lián)步驟,①SDS-PAGE非還原性電泳,②紫外分光光度法粗測偶聯(lián)比,③液質(zhì)聯(lián)用測量藥物抗體偶聯(lián)比例,二、偶聯(lián)比的測定,三、其他血管阻斷藥物偶聯(lián)備選E

12、NMD-1198反式-3，5，4'-三甲氧基白藜蘆醇血栓素蛇毒蛋白(SVTLE),2.2.5 偶聯(lián)物純化，偶聯(lián)比檢測方法,對比試驗同類篩選,2.2.7 臨床前研究,實驗試劑：人胰腺癌細胞細胞株，SPF級BALB/C小鼠人源細胞荷瘤裸鼠模型的建立：取對數(shù)生長期的胰腺癌細胞，用無血清培養(yǎng)基重懸至濃度為2*107個。選取體重20g左右，6~8周齡的雌性小鼠，腹腔注射麻醉劑，待麻醉后，于右側(cè)背部皮下注射細胞懸液進行接種。腫瘤

13、生長至200mm3時，進行后續(xù)試驗。,2.2.7 臨床前研究,1.檢查藥物的靶向性：用熒光標記的抗DEL-1單抗-凝血酶藥物經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，分別在給藥4,12,24,48h后，對老鼠進行活體熒光檢測。24h后處死小鼠，收集心、肝、脾、腎、肺、腫瘤等組織檢測熒光強度。,2.2.7 臨床前研究,2.3 可行性說明,,,,,,可行性分析,二、小分子抗體制備,小分子抗體分子量小，方便攜帶凝血酶原并通過血液循環(huán)運輸?shù)桨悬c。保留抗原識別功

14、能，摒棄了Fc段無關(guān)作用。,四、偶聯(lián)物純化，偶聯(lián)比檢測,交聯(lián)劑選擇分子量較小的，在體內(nèi)穩(wěn)定性較好偶聯(lián)物和小分子藥物結(jié)合時，結(jié)合基團的選擇原則是盡量降低其異物性小分子藥物達到靶點可能無法解離，無法發(fā)揮藥效,三、凝血酶原修飾,如果凝血酶原在運輸途中掉落，可對其進行固定化如果凝血酶原太大可對其進行修飾，不過可能改變其親和力。如果凝血酶原的親和力無法達到要求，則對其進行基因工程改造，添加新的抗原表位若凝血酶原上無法構(gòu)建出適合的抗原表位

15、，則選用凝血系統(tǒng)中的其他凝血因子，重復(fù)以上實驗,一、del-1的獲取,所需骨髓瘤細胞和小鼠皆可購買，構(gòu)建方法簡單已知凝血酶原與del—1存在交叉抗原RGD，很可能是我們需要的抗原表位,,,,,2.3 可行性說明,,,,應(yīng)用前景,Part 3,,應(yīng)用前景,,,,,,,,,,,,應(yīng)用前景一,應(yīng)用前景二,應(yīng)用前景三,為腫瘤血管阻斷劑及新生血管抑制劑，雙效藥物的制備提供研究基礎(chǔ),用于胰腺癌、肝癌、肺癌、大腸癌的輔助治療,Del-1抗體還可以與