細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)

1、2024/3/24,1,細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)種類,,細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)主要是對各種免疫細(xì)胞進(jìn)行分離、鑒定、計數(shù)，并測定其功能。,細(xì)胞分離技術(shù)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測 T細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測 B細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測 NK細(xì)胞活性的檢測 吞噬細(xì)胞檢測技術(shù),2024/3/24,2,第一節(jié) 免疫細(xì)胞的分離技術(shù),一、標(biāo)本的采取與保存二、細(xì)胞分離技術(shù)三、分離標(biāo)本的保存技術(shù),2024/3/24,3,第一節(jié)

2、細(xì)胞的分離技術(shù),一、標(biāo)本的采取與保存（一）血液標(biāo)本的采取 無菌采血，抗凝1、機械去纖維蛋白法（玻璃珠法）采血過程中，邊采邊搖采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滾動，以機械地除去纖維蛋白，使血液不能凝固。本法雖較麻煩，但本法簡便、對淋巴細(xì)胞的活性影響最小，且可減少血小板的混雜。2、肝素抗凝法 肝素能阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，進(jìn)而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白，防止血液凝固。 3、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝法 EDTA為螯合劑

3、，可與血液中鈣離子結(jié)合而抗凝。 馬、牛、羊等大動物一般從頸靜脈采血，豬從頸靜脈、前腔靜脈或耳靜脈采血，家禽由翼下靜脈或心臟采血，兔由心臟或耳靜脈采血，犬由頸靜脈或四肢靜脈采血，豚鼠由心臟采血，小白鼠則可斷尾或剪斷腋下血管或剪斷眼球采血。,,馬、牛、,羊等大動物一般從頸靜脈采血，,豬從頸靜脈、,前腔靜脈或耳靜脈采血，,家禽由翼下靜脈或心臟采血，,兔由心臟或耳,靜脈采血，,犬由頸靜脈或四肢靜脈采血，,豚鼠由心臟采血，,小白鼠則可斷尾或剪斷

4、,腋下血管或剪斷眼球采血。,2024/3/24,4,第一節(jié) 細(xì)胞的分離技術(shù),一、標(biāo)本的采取與保存（二）胸腺細(xì)胞懸液的制備 【方法】 4周齡健康小鼠，體重14~16g。 （1）小鼠頸椎脫臼處死。 （2）迅速取出胸腺。置于100目鋼網(wǎng)上。注意無菌，洗干凈胸腺上的血管。 （3）輕輕研磨，制成細(xì)胞懸液。 （4）用臺盼藍(lán)染色，計數(shù)?；罴?xì)胞數(shù)＞90%。,看視頻,2024/3/24,5,第一節(jié) 細(xì)胞的分離技術(shù)

5、,一、標(biāo)本的采取與保存（三）巨噬細(xì)胞的采取1、人巨噬細(xì)胞的收集（斑蝥酊敷貼法）2、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備【方法】20-25g小白鼠（1）小鼠頸椎脫臼處死（2）腹部消毒，無菌注入肝素-Hanks液（3）吸出腹腔液，洗滌，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度,2024/3/24,6,第一節(jié) 細(xì)胞的分離技術(shù),二、細(xì)胞分離技術(shù) （一）外周血白細(xì)胞的分離 根據(jù)人外周血紅細(xì)胞與白細(xì)胞的比重不同，其沉降速度隨之而異。 1、自然沉降法

6、 利用RBC自然沉降率較快的分離法。 抗凝血于室溫或37℃靜置30~60分鐘，血液即分成明顯的3層： 上層為淡黃色血漿， 緊貼紅細(xì)胞上面的灰白層為白細(xì)胞 底層為紅細(xì)胞 本法所得的白細(xì)胞損傷極輕微。,2024/3/24,7,第一節(jié) 細(xì)胞的分離技術(shù),一、標(biāo)本的采取與保存（一）外周血白細(xì)胞的分離 2、加速紅細(xì)胞沉降法 利用高分

7、子量的聚合物（明膠）使紅細(xì)胞凝聚成串錢狀，借以加速紅細(xì)胞沉降，使之快速與白細(xì)胞分離。 上層富含白細(xì)胞 紅細(xì)胞凝聚成串錢狀沉積在底層， 本法的細(xì)胞得率比自然沉降法高，但明膠增加白細(xì)胞粘性，對實驗有所影響。,2024/3/24,8,第一節(jié) 細(xì)胞的分離技術(shù),一、標(biāo)本的采取與保存（二）外周血單個核細(xì)胞的分離 （PBMC）[基本原理] 根據(jù)人類各種血細(xì)胞的比重有所不同，利用一種比重介于1.075~1.

8、092之間而接近等滲的分層液作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞群按相應(yīng)密度梯度分布，從而得以分離各種血細(xì)胞群。,2024/3/24,9,第一節(jié) 細(xì)胞的分離技術(shù),一、標(biāo)本的采取與保存（三）淋巴細(xì)胞及其亞群的分離 1、淋巴細(xì)胞的分離①玻器吸附法 將分離的單個核細(xì)胞傾于無菌潔凈的玻璃平皿內(nèi)，置37℃ 30 min～40min，用毛細(xì)吸管輕輕吸取懸液，即為淋巴細(xì)胞。用適量的Hank’s液沖洗平皿，收獲即為單核細(xì)胞懸液。 ②L-亮氨酸甲基

9、酯法 單核-巨噬細(xì)胞內(nèi)富含溶酶體酶，它能攝取嗜溶酶體的L-亮氨酸甲基酯，集中于溶酶體上，使該酯轉(zhuǎn)化為對細(xì)胞本身有毒性的L-lencyl亮氨酸甲基酯，但不影響T、B、NK等細(xì)胞。用本法獲得的淋巴細(xì)胞純度大于99％，活力＞95％。,2024/3/24,10,第一節(jié) 細(xì)胞的分離技術(shù),一、標(biāo)本的采取與保存（三）淋巴細(xì)胞及其亞群的分離 2、淋巴細(xì)胞亞群的分離 根據(jù)表面的標(biāo)志不同，建立能選擇性純化所需細(xì)胞的技術(shù)。①E花環(huán)試驗

10、 分離T細(xì)胞群②尼龍毛分離方法 分離T、B細(xì)胞③親和層析原理分離淋巴細(xì)胞亞群 去除某一細(xì)胞群④熒光激活細(xì)胞分離儀（FACS） 最佳分離方法磁性微球用于細(xì)胞的分離和純化（MACS技術(shù) ）,2024/3/24,11,免疫磁性微球的分離原理,直接法對細(xì)胞進(jìn)行分類,間接法對T細(xì)胞進(jìn)行分離,,2024/3/24,12,第一節(jié) 細(xì)胞的分離技術(shù),三、分離標(biāo)本的保存技術(shù)液氮深低溫（－196℃）保存技術(shù) 但降溫過程由

11、于冰晶的形成和滲透壓的改變，可導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和部分死亡。因此在冷凍過程要加冷凍保存劑，常用二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)。1、冷凍保存 將待凍細(xì)胞懸液加冷凍保存劑，并配成適當(dāng)濃度，分裝小管。采用兩步降溫法，即及時迅速地將其降溫至一選擇好的臨界低溫作為過渡站，如一80℃低溫冰箱過夜，或放在液氮罐液面以上一層空間15~20h，然后再移放或沉入液氮中。2、復(fù)蘇 復(fù)蘇解凍必須迅速，力爭在20s內(nèi)

12、使細(xì)胞完全融化。從液氮中取出后迅速移至40℃溫水中，融化后要充分洗滌重懸于新鮮培養(yǎng)液中，使細(xì)胞恢復(fù)活力。,2024/3/24,13,第二節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測,一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測 （一）T淋巴細(xì)胞受體的檢測1、E受體的檢測 （現(xiàn)多用于分離T細(xì)胞）2、白細(xì)胞介素-2受體的檢測 T細(xì)胞激活的特征 （多采用免疫組化學(xué)法）,2024/3/24,14,第二節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功

13、能的檢測,一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（二）表面抗原的檢測 用單抗檢測T細(xì)胞表面抗原方法：標(biāo)記抗體著染法 抗體致敏花環(huán)法 1、間接免疫熒光法 淋巴細(xì)胞+抗相應(yīng)CD的單抗→洗滌→ 再加熒光二抗→ 洗滌→取樣制片→熒光顯微鏡觀察計數(shù)l00~200個淋巴細(xì)胞，以熒光陽性細(xì)胞與計數(shù)細(xì)胞總數(shù)之比為相應(yīng)CD抗原陽性的T細(xì)胞百分率。,2024/3/24,15,第二節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測,一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（二）表

14、面抗原的檢測 2、抗體致敏細(xì)胞花環(huán)法 淋巴細(xì)胞懸液 + 抗CD抗體致敏的RBC懸液→置室溫片刻，經(jīng)低速離心→移放室溫1小時 / 4℃過夜后→ 重懸取樣涂片染色鏡檢 共計100~200個淋巴細(xì)胞，以花環(huán)形成細(xì)胞數(shù)與計數(shù)細(xì)胞總數(shù)之比為相應(yīng)CD抗原陽性細(xì)胞的百分率。,2024/3/24,16,第二節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測,一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（三）T細(xì)胞功能的檢測 1、T細(xì)胞增殖試驗（ T細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗）

15、 判斷T細(xì)胞功能的一項非特異性體外免疫學(xué)檢測指標(biāo)。[基本原理] 在體外T細(xì)胞與刺激物共育后，細(xì)胞代謝和形態(tài)相繼會發(fā)生一系列的變化，在24~48h內(nèi)，蛋白質(zhì)和核酸合成增加，最終T細(xì)胞呈母細(xì)胞化，出現(xiàn)分裂增殖現(xiàn)象。 有形態(tài)計數(shù)法和放射性核素計數(shù)法兩種,2024/3/24,17,第二節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測,一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（三）T細(xì)胞功能的檢測 2、T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒 （LMC）試驗 評價機體細(xì)胞免疫

16、水平的一種常用指標(biāo)， 腫瘤患者的判斷預(yù)后和觀察療效的指標(biāo)之一。 （1）形態(tài)學(xué)檢查法 淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞→混合共溫培養(yǎng)后→ 瑞氏染色→ 光鏡計數(shù)殘留的腫瘤細(xì)胞數(shù)，計算殺傷率。 本法不需特殊設(shè)備，操作較方便，但敏感性較差，不能確切反映細(xì)胞的損傷和死亡,2024/3/24,18,第二節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測,一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（三）T細(xì)胞功能的檢測 2、T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒 （LMC）試驗（

17、2）放射性核素法 一般采用125I-UdR摻入法或51Cr釋放法。,2024/3/24,19,第二節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測,二、B細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（一）受體的檢測 SmIg標(biāo)志的檢測 多采用間接熒光免疫法或酶免疫組織化學(xué)法（二）表面抗原的檢測 用相應(yīng)的CD系列單抗，用熒光免疫、酶免疫組織化學(xué)技術(shù)加以檢測 CDl9、CD20、CD22、CD27等抗原,2024/3/24,20,第二節(jié)

18、免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測,二、B細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（三）B細(xì)胞功能的檢測 1、血清中免疫球蛋白含量測定 檢測方法：瓊脂單向擴散試驗，方法較粗糙； 現(xiàn)用ICS儀作自動速率散射比濁法， 迅速可靠。,2024/3/24,21,,,2024/3/24,22,第二節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測,二、B細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（三）B細(xì)胞功能的檢測 2、

19、細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的體外試驗 檢測B細(xì)胞體外產(chǎn)生抗體的能力，不僅可以了解B細(xì)胞功能，還可研究B細(xì)胞分化增殖所需的條件，以及T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等與B細(xì)胞相互作用的調(diào)節(jié)機制。,2024/3/24,23,第二節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測,二、B細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（三）B細(xì)胞功能的檢測 2、細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的體外試驗 （1）溶血空斑技術(shù)又稱空斑形成細(xì)胞試驗[基本原理] 用SRBC免疫動物不同天數(shù)后，取脾臟制成細(xì)胞

20、懸液。將其與SRBC在半固體瓊脂凝膠內(nèi)混合，傾注于平皿或玻片上使成薄層，置37℃溫育?？贵w生成細(xì)胞可釋放抗SRBC抗體，后者與周圍SRBC結(jié)合使補體活化而產(chǎn)生溶血，在細(xì)胞周圍形成一個肉眼可見的透明溶血區(qū)，稱為溶血斑。每個空斑表示一個抗體生成細(xì)胞。,2024/3/24,24,,,2024/3/24,25,第二節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測,三、NK細(xì)胞活性的檢測（一） NK細(xì)胞活性檢測的方法 1、形態(tài)學(xué)檢測法[基本原理] 將效

21、-靶細(xì)胞按一定比例混合共溫后，用臺盼藍(lán)、伊紅丫等（活細(xì)胞拒染）染料染色，分別計數(shù)著染的死細(xì)胞和不著染的活細(xì)胞，由此推算NK細(xì)胞的殺傷活性。用臺盼藍(lán)染色，須在3min內(nèi)完成計數(shù)，否則活細(xì)胞也將開始攝取染料而著染。伊紅丫染色在1~10min內(nèi)，死、活細(xì)胞比例不變。本法簡便易于掌握，但主觀因素較大，也無法計出遭輕微損傷的細(xì)胞。,2024/3/24,26,第二節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測,三、NK細(xì)胞活性的檢測（一） NK細(xì)胞活性檢

22、測的方法 2、酶釋放檢測法[基本原理] 將效-靶細(xì)胞共育一段時間后，根據(jù)靶細(xì)胞破壞后釋放的酶量推斷死亡的細(xì)胞數(shù)。通常以乳酸脫氫酶和堿性磷酸酶為檢測指標(biāo)。取共育后離心的上清液，加酶底物顯色。根據(jù)光密度的變化確定酶含量的多少。[特點] 經(jīng)濟(jì)、快速、簡便，可定量。 [影響因素] 有培養(yǎng)液、pH、溫度以及終止反應(yīng)的時間等。實際操作時要嚴(yán)格掌握條件,2024/3/24,27,第二節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測,三、NK細(xì)胞活性的檢

23、測（二）NK細(xì)胞活性檢測的臨床意義 臨床的輔助診斷以及判斷預(yù)后，考核療效,2024/3/24,28,第二節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測,四、吞噬細(xì)胞檢測技術(shù)（一）中性粒細(xì)胞的檢測 中性粒細(xì)胞的檢測包括數(shù)量、細(xì)胞運動功能以及吞噬和殺菌功能的檢測。1、中性粒細(xì)胞吞噬和殺菌功能的檢測 受檢細(xì)胞懸液內(nèi)按一定比例加入活的白色念珠菌懸液，混合保溫后，加亞甲藍(lán)(美藍(lán))溶液作活體染色，取樣涂片作光鏡檢查。如胞內(nèi)白色念珠菌呈藍(lán)色，表示

24、該菌已被殺死，共計100~200個細(xì)胞，分別求其吞噬率①和殺菌率②。,2024/3/24,29,第二節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測,四、吞噬細(xì)胞檢測技術(shù)（一）中性粒細(xì)胞的檢測 中性粒細(xì)胞的檢測包括數(shù)量、細(xì)胞運動功能以及吞噬和殺菌功能的檢測。1、中性粒細(xì)胞吞噬和殺菌功能的檢測 正常情況下，對大腸桿菌的殺菌率＞90％，對金黃色葡萄球菌的殺菌率＞85％,2024/3/24,30,第二節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測,四、吞噬

25、細(xì)胞檢測技術(shù)（二）巨噬細(xì)胞功能的檢測巨噬細(xì)胞功能的檢測包括有炭粒廓清試驗、吞噬功能檢測、溶酶體酶的測定、巨噬細(xì)胞促凝血活性測定，以及分泌功能和表面標(biāo)志檢測等。,2024/3/24,31,第二節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測,四、吞噬細(xì)胞檢測技術(shù)（二）巨噬細(xì)胞功能的檢測1、巨噬細(xì)胞功能的化學(xué)發(fā)光法測定 [基本原理] 單核-巨噬細(xì)胞激活后也能引起呼吸爆發(fā)而產(chǎn)生O2－、H2O2、1O2、OH、OCl－等超氧陰離子，并伴隨產(chǎn)