豬偽狂犬疫苗研究進(jìn)展

1、豬偽狂犬疫苗研究進(jìn)展,吉藝寬,豬偽狂犬病毒 (Pseudorabies virus),偽狂犬病毒又名豬皰疹病毒1型，屬皰疹病毒甲亞科的成員。豬為病毒的原始宿主，并作為貯主，可感染其他動物如馬、牛、綿羊、山羊、犬、貓及多種野生動物，不感染人。,一、病毒特性,二、疾病的臨床癥狀,妊娠母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎和木乃伊胎，以產(chǎn)死胎為主。新生仔豬大量死亡、15日齡以內(nèi)仔豬死亡率為100% 。斷奶仔豬發(fā)病死亡，發(fā)病率20-40%，死亡率10-20

2、%，主要表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀、拉稀、嘔吐等。,母豬不發(fā)情、返情、屢配不孕等。公豬不育、發(fā)生睪丸腫脹、萎縮，失去種用能力。 育肥豬表現(xiàn)為慢性呼吸道癥狀、增重遲緩、飼料報(bào)酬降低、推遲上市的時(shí)間,豬偽狂犬疫苗的研究進(jìn)展,目前，疫苗接種是預(yù)防、控制甚至消滅豬偽狂犬病主要的措施之一。國內(nèi)外已研制出豬偽狂犬病的滅活疫苗、弱毒疫苗、基因缺失弱毒疫苗已經(jīng)相對成熟，而病毒載體重組疫苗、核酸疫苗、亞單位疫苗尚處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。,一、滅活疫苗,滅活疫苗是

3、將豬偽狂犬病毒接種于雞 胚或細(xì)胞，當(dāng)病毒滴度達(dá)到要求時(shí)收獲病毒，滅活后加入免疫佐劑，從而制成滅活疫苗。,,1. 滅活疫苗優(yōu)點(diǎn)。安全性高，不會引起散毒，也不會帶來潛伏感染的問題。2. 滅活疫苗缺點(diǎn)。滅活疫苗不能將內(nèi)源性蛋白抗原提呈給免疫系統(tǒng)，因而不能誘導(dǎo)細(xì)胞毒 T 細(xì)胞反應(yīng) (CTL)。皰疹病毒本身的免疫原性與毒力有一定的相關(guān)性，因此滅活疫苗的免疫 效果一般較差，并且滅活疫苗使用的免疫劑量較大，偶爾會發(fā)生過敏反應(yīng)，故在生產(chǎn)上已經(jīng)較少

4、應(yīng)用。,二、自然缺失弱毒活疫苗,弱毒活疫苗是將分離到的野毒株經(jīng)非豬源細(xì)胞反復(fù)傳代，或適應(yīng)雞胚，或加入致突變劑在高于一般的培養(yǎng)溫度條件下，在細(xì)胞上反復(fù)傳代而獲得的疫苗，如匈牙利的Bartha 株、羅馬尼亞的 Bucharest株、BUK 株、TK200 株、 北 愛 爾蘭的 NIA4 株、法國 Alfort-26 株、前蘇聯(lián)的 VGNK-I 株、保加利亞MK25 株、南斯拉夫的 Bkal68 株和Govacc 株等弱毒株。目前使用較多的是

5、 Bartha、Buk 毒株。,,我國目前廣泛使用的 PR 弱毒凍干 疫 苗 (Bartha-k61) 是 一 種 gI ／gE 雙基因缺失弱毒疫苗，由于該基因缺失而進(jìn)一步阻斷弱毒株回復(fù)毒力的可能性，所以大大提高了這種弱毒苗的安全性。,,1. 自然缺失弱毒活疫苗的優(yōu)點(diǎn)。弱毒苗具有良好的免疫原性，而且價(jià)格低廉，至今仍在偽狂犬病的防控中起著重要的作用。2. 自然缺失弱毒活疫苗的缺點(diǎn)。未經(jīng)充分致弱的弱毒苗的毒力可能會返強(qiáng)而導(dǎo)致疾病的流行 ；

6、弱毒疫苗可建立潛伏感染，并有可能散毒。,三、基因工程疫苗,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，豬偽狂犬病病毒的基因組結(jié)構(gòu)、基因缺失對病毒生物學(xué)性質(zhì)和免疫原性的影響得到了廣泛研究，豬偽狂犬基因工程疫苗的研究得到更深入的發(fā)展。豬偽狂犬基因工程疫苗包括 ：基因工程缺失弱毒活疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、重組病毒疫苗。,（一）基因工程缺失弱毒活疫苗,豬偽狂犬基因缺失主要包括對與毒力相關(guān)的基因如 TK、RR、gE、gl等基因的缺失以降低病毒毒力 ；對糖蛋白基因如

7、 gG、gC、gD 等基因的缺失以引入選擇標(biāo)記或阻止感染性病毒的產(chǎn)生，從而致弱豬偽狂犬病毒，同時(shí)又保持其較強(qiáng)的免疫原性?；蚬こ倘笔б呙绲难兄剖加?0 世紀(jì) 80 年代初。,,1. 第一代基因缺失疫苗。第一代基因缺失疫苗指缺失 PRV 一個(gè)主要的 毒力基因獲得的疫苗。1984 年，Kit 等以 PRV BUK 為起始材料，并以 BUK 疫苗株為親本，通過缺失TK（腺苷激酶）基因序列中的 148bp 片段， 構(gòu)建出PR

8、V 的 TK 缺 失 株 PRV BUK-d13 株。試驗(yàn)證明，該疫苗對豬是安全 的，并能提供有效的保護(hù)，5 ～ 6周齡豬在免疫接種后能產(chǎn)生中和抗 體，在攻毒后能表現(xiàn)出再次免疫應(yīng)答。Quint 等 對 PRV NIA-3 株 的US 區(qū)進(jìn)行部分缺失 (gE 基因缺失 )，構(gòu)建的 PRV 突變株能明顯降低 PRV 對小鼠和 10 周齡仔豬的毒力，可使免疫豬能抵抗強(qiáng)毒的致死攻擊。但 該突變株對 3 日齡仔豬仍

9、具有較強(qiáng)的毒力。TK 基因缺失疫苗不僅能較 好地免疫豬只，而且免疫豬后還可以通過 PCR 的方法將免疫接種豬與 自然感染豬區(qū)分開來。但是，由于 TK 基因?qū)儆诿傅鞍谆颍隗w內(nèi)不 能產(chǎn)生其相應(yīng)的抗體，因此僅缺失 TK 基因不能用血清學(xué)方法區(qū)別開免 疫接種豬與自然感染豬，要將此區(qū)別開來必須缺失相應(yīng)的糖蛋白基因。 鑒于此，許多學(xué)者在 TK基因缺失的基礎(chǔ)上又缺失了相應(yīng)的糖蛋白基因 而構(gòu)建了含 TK 基因缺失

10、的雙缺失和多缺失疫苗株。,,2. 第二代基因缺失疫苗。第二代基因缺失疫苗除了在 TK 基因引入了一個(gè)缺失外，在非編碼必需糖蛋白的基因內(nèi)引入了一個(gè)新的缺失?；虿迦胍粋€(gè)報(bào)告基因，這樣得到的突變株就不能產(chǎn)生被缺失的糖蛋白，因而免疫動物就不能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，因此可以通過血清學(xué)方法將免疫接種豬與自然感染野毒的豬相區(qū)別。這也是第二代基因缺失疫苗的最顯著特點(diǎn)。還值得注意的是有些糖蛋白的缺失，可以進(jìn)一步降低毒力。第一個(gè)申請專利并注冊使用的PRV 基因工

11、程疫苗 OM-NIVAC-PRV 就是 TK 基因缺失疫苗。在我國， PRV Ea TK- 株基礎(chǔ)上構(gòu)建了 PRV Ea TK-/gG-、TK-/gE- 疫苗株,,上述基因缺失疫苗的構(gòu)建成功，為偽狂犬病的根除計(jì)劃打下了物質(zhì)基礎(chǔ)。除此之外，人們還將注意力集中在核苷酸還原酶 (RR)、蛋白激酶 (PK)、堿性酸外切酶、脫氧尿苷三磷酸激酶等與 PRV 毒力相關(guān)的基因上，試圖通過缺失這些基因，更進(jìn)一步地降低疫苗毒株的殘余毒力，從而使突變株更為

12、安全。,,（1）基因工程缺失弱毒活疫苗優(yōu)點(diǎn) ：都缺失了目的基因的幾百甚至幾千個(gè)堿基，缺失區(qū)域明確，所以它們返祖的可能性極小。PRV 缺失株一般都缺失了一個(gè)或幾個(gè)毒力基因，所以大多數(shù) PRV 缺失株對鼠、豬無毒力或僅有較低的毒力，但是，僅缺失 TK 基因的弱毒株對犢牛還有較低的毒力，而對貓、狗毒力較強(qiáng)，若同時(shí)再缺失 gC 或 gE 基因，則幾乎不表現(xiàn)出毒力。大多數(shù)的 PRV 缺失疫苗株都有較強(qiáng)的免疫原性，免疫動物都獲得了較強(qiáng)的保護(hù)力。強(qiáng)毒

13、攻擊免疫豬只出現(xiàn)臨床癥狀和增重受阻，而豬只的排毒時(shí)間大大縮短，排毒量也大大降低。,,（2）基因工程缺失弱毒活疫苗缺點(diǎn) ：基因缺失疫苗能否引起潛伏感染或被激活為感染性病毒令人擔(dān)憂。基因缺失疫苗在動物體內(nèi)與野毒或不同的基因缺失疫苗間發(fā)生基因重組而突變成強(qiáng)毒株，從而成為新的傳染源，這種可能性是存在的?；蛉笔б呙缭诮臃N后也存在潛伏感染和排毒的問題。,（二）亞單位疫苗,亞單位疫苗是利用 PRV 保護(hù)性抗原基因，在原核或真核系統(tǒng)中表達(dá)所獲得的產(chǎn)物

14、制成的疫苗。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn) PRV 有11 種 糖 蛋 白， 其 中，gB、gC、gD均為刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的蛋白，所產(chǎn)生的抗體無論是在體內(nèi)、體外，還是在有無補(bǔ)體存在的情況下都有中和 PRV 的能力，因此，gB、gC、gD 是研制 PRV 亞單位疫苗的首選糖蛋白。,,1. 亞單位疫苗的優(yōu)點(diǎn)。不含有核酸物質(zhì)因此比較安全，接種后不會產(chǎn)生持續(xù)感染或潛伏感染。產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以與野毒感染相區(qū)分，有利于疫病的控制和消滅。2. 亞單位疫苗的缺點(diǎn)。

15、生產(chǎn)成本高，免疫原性不及弱毒疫苗及滅活疫苗，應(yīng)用受到限制。,（三）核酸疫苗,核酸疫苗是指將編碼外源蛋白質(zhì)的核酸表達(dá)載體注射入機(jī)體，以 激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對外源蛋白質(zhì)特異性的免疫應(yīng)答。Gerdts等將 PRV gC 或 gD 基因置于人巨細(xì)胞病毒的主要立即早期啟動子下游 構(gòu) 建 了 DNA 疫 苗。 用 表 達(dá) gC的核酸疫苗免疫能完全保護(hù) 抵抗PRV-75V19 毒株的致死性攻擊，并能保護(hù)豬部分抵抗 PRV

16、 強(qiáng) 毒 NIA-3株的攻擊 ；但用表達(dá) gD 的核酸疫苗免疫卻不能保護(hù)豬 抵抗 PRV 強(qiáng)毒株的攻擊。用 gC 核酸疫苗肌肉或皮下免疫 3 次， 血清中能檢測到抗 gC的抗體，并可使豬對 NIA-3 產(chǎn)生部分，還 能產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng) 答。Montail 等 (1996) 構(gòu) 建 了 含PRV gD 基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。以其接種新生仔豬，結(jié)果顯示，未曾加 強(qiáng)免疫過的仔豬和經(jīng)過加強(qiáng)免疫

17、的仔豬，都能夠產(chǎn)生中等水平的 中和抗體，但對 PRV 的攻擊不具保護(hù)力。編碼 gB 的 DNA 疫苗 可誘導(dǎo)豬的細(xì)胞免疫并減少排毒。,,1. 核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)。能克服偽狂犬病病毒的潛伏感染，安全性高，免疫期長，而且能激發(fā)細(xì)胞免疫。2. 核酸疫苗的缺點(diǎn)。雖然核酸疫苗的免疫能產(chǎn)生較高的抗體水平，但對強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)力不理想，因此，核酸疫苗的廣泛應(yīng)用還有一段漫長的路要走。,（四）重組疫苗,1. 以腺病毒為載體的重組疫苗

18、ELA 基因編碼腺病毒的主要轉(zhuǎn)錄激活因子，因此 ELA －腺病毒在不表達(dá) ELA 的細(xì)飽中，不能復(fù)制。Hammond JM 等以這種復(fù)制缺陷型腺病毒為載體構(gòu)建了 1 株表達(dá)PRVgD 的 ELV- 重組腺病毒 PRV-gD。用該重組病毒通過多種途徑分別接種兔和小鼠，均能產(chǎn)生對 gD 的免疫應(yīng)答。一些免疫接種的動物可以抵抗致死量 PRV 的攻擊 ；豬接種重組病毒能產(chǎn)生高水平的抗 gD 抗體，并能有效抵抗強(qiáng)毒的攻擊。,,2. 以豬痘病毒為載

19、體的重組疫苗 豬痘病毒甚因組容量大，可以插入較大的或多個(gè)外源片段 。由于豬是其唯一宿主，因此，豬痘病毒作為載體，除了具有痘病毒載體的優(yōu)越性外，還具有豬宿主特異性的特點(diǎn)。Van dre Leek 等，（1999）將PRV gD 和 gI 基因插入豬痘病毒中，用獲得的重組病毒接種豬，能使豬獲得對 PRV 強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)。,,3. 豬偽狂犬病毒載體 豬的重組疫苗大多是以豬偽狂犬病毒為載體。PRV 是雙鏈 DNA 病毒，基因組長達(dá)

20、 150Kb，其中存在許多病毒復(fù)制非必需的基因，允許插入外源基因，這表明 PRV 本身就是潛在的病毒載體。最近 PRV 己被構(gòu)建成表達(dá)外源基因的強(qiáng)有效的表達(dá)載體。盡管這些載體還沒有一種獲得實(shí)際應(yīng)用，但是 ( 缺失 gE) 被標(biāo)記的PRV 與經(jīng)典豬瘟的重組病毒確實(shí)有助于用一種疫苗免疫來同時(shí)預(yù)防這兩種豬的毀滅性疾病。已確定了許多不同的位點(diǎn)可以用于插入幾種不同的外源基因。,,4. 重組疫苗的優(yōu)點(diǎn)。載體病毒較穩(wěn)定，免疫原性持久，刪除毒力基因的活

21、載體疫苗能誘發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，避免了滅活苗免疫的缺點(diǎn)，接種方便安全。5. 重組疫苗的缺點(diǎn)。有些載體對人或動物具有潛在致病性，對人或動物具有潛在的威脅。另外，重復(fù)使用會使動物對載體病毒產(chǎn)生免疫反應(yīng)。,豬偽狂犬病疫苗的總結(jié),豬偽狂犬病極大地危害著世界各國的養(yǎng)殖業(yè)，在豬偽狂犬的眾多疫苗中，基因缺失疫苗免疫能與自然感染相區(qū)分，一些國家已推廣使用基因缺失疫苗( 多為 gE- 表型 ) 免疫豬群，配以相應(yīng)的鑒別診斷方法來實(shí)施豬偽狂犬凈化計(jì)劃，