皮膚刺激皮內(nèi)試驗(yàn)

1、刺激試驗(yàn),刺激是不涉及免疫學(xué)機(jī)制的一次、多次或持續(xù)與試驗(yàn)材料接觸所引起的局部炎癥反應(yīng)。,皮膚刺激試驗(yàn),評(píng)價(jià)材料在試驗(yàn)條件下產(chǎn)生皮膚刺激反應(yīng)的潛在性。 家兔為首選，預(yù)期無(wú)反應(yīng)，可直接使用3家兔。,試驗(yàn)材料與儀器,天平精度 0.01或0.1g 供試品稱(chēng)量用精度 0.1或1mg 試劑稱(chēng)量用精度 50g 試驗(yàn)用兔稱(chēng)量用兔

2、固定裝置、手術(shù)剪刀、推子、游標(biāo)卡尺、稱(chēng)量瓶、吸管、移液管、包扎帶、醫(yī)用紗布、燒杯、壓力蒸汽滅菌器。,試劑與器具滅菌,試劑 75%(V/V)乙醇、0.9％氯化鈉注射液或其它規(guī)定的浸提介質(zhì)。器具滅菌與供試品接觸的所有器具應(yīng)采用可靠的方法滅菌，置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃恒溫20分鐘，或置電熱干燥箱內(nèi)160℃干烤2h。,試驗(yàn)動(dòng)物 應(yīng)使用清潔級(jí)健康、初成年的、未使用過(guò)的試驗(yàn)用（新西蘭）兔，雌雄兼用, 同一品系,同一飼養(yǎng)條件，體重應(yīng)不

3、低于2kg。,試驗(yàn)用兔的抓取固定方法試驗(yàn)用兔比較馴服不會(huì)咬人，但腳爪較尖應(yīng)避免兔抓傷。進(jìn)行刺激試驗(yàn)時(shí)，只需將兔抓牢或按住即可，抓兔的方法是用右手把兩耳輕輕地拿在手心，抓住頸后部的皮厚處，提取兔，然后用左手托住臀部，使兔的體重大部分落在左手上，不能單提兩耳、捉拿四肢、提抓腰部和背部。,預(yù)試驗(yàn)試驗(yàn)材料應(yīng)使用1只動(dòng)物進(jìn)行初試。如動(dòng)物出現(xiàn)清晰紅斑或水腫時(shí)，不必再進(jìn)行其他試驗(yàn)。如試驗(yàn)動(dòng)物沒(méi)有出現(xiàn)清晰的紅斑或水腫反應(yīng)時(shí),應(yīng)至少再選用2只動(dòng)物

4、進(jìn)行試驗(yàn)。,試 驗(yàn) 步 驟,動(dòng)物準(zhǔn)備 試驗(yàn)前一天, 將試驗(yàn)用兔人工固定或固定到固定裝置上，然后把背部脊柱兩側(cè)的被毛用手術(shù)剪粗剪后再用推子小心的把被毛去除干凈(約10cm×15cm區(qū)域),作為試驗(yàn)和觀察部位。去毛過(guò)程應(yīng)確保動(dòng)物皮膚健康無(wú)損傷。,試驗(yàn)方法,試驗(yàn)前用75％的(V/V)乙醇擦拭背部去毛區(qū)域，等變干后根據(jù)供試品的不同性狀選用不同的方法進(jìn)行操作。,粉劑或液體樣品 取0.5g或0.5mL的試驗(yàn)材料，直接涂抹

5、到剃毛皮膚部位。粉劑使用前用少量的水制成糊狀，有利于涂抹。 用25mm×25mm透氣性好的敷料敷貼涂抹樣品的皮膚部位, 然后敷料外層用紗布包裹，再用半封閉性包扎帶固定敷料和紗布4h以上。接觸期結(jié)束后依次取下包扎帶、紗布及敷料, 對(duì)接觸部位進(jìn)行標(biāo)記,用溫水清洗并擦干。,固體樣品研成粉末，試驗(yàn)材料可用水充分濕化以保證與皮膚良好的接觸性。用25mm×25mm的透氣性好的敷料塊覆蓋材料接觸部位, 然后敷料外層

6、用紗布包裹，再用半封閉性包扎帶固定敷料和紗布4h以上，依次取下包扎帶、紗布及敷料, 對(duì)接觸部位進(jìn)行標(biāo)記,用溫水清洗并擦干。,藥包材：鋁質(zhì)軟膠管：取試樣5 支，向每支加入標(biāo)示容量的0.9％氯化鈉注射液，振蕩5分鐘后，合并提取液備用。一般材料：取平整部位表面積600cm2剪碎，加入氯化鈉注射液100mL，70℃放置24小時(shí)后取出冷卻備用。,0.9％氯化鈉注射液及其浸提液 將浸提液滴到25mm×25mm的4層紗布?jí)K上(每

7、塊約0.5mL), 按下圖所示部位敷貼于動(dòng)物背部?jī)蓚?cè)。將滴有0.9％氯化鈉注射液的紗布?jí)K敷貼在對(duì)照接觸部位。 然后敷料外層用紗布包裹，再用半封閉性包扎帶固定敷料和紗布4h以上，依次取下包扎帶、紗布及敷料, 對(duì)接觸部位進(jìn)行標(biāo)記,用溫水清洗并擦干。,,去毛的背部區(qū)域,對(duì)照部位,供試品部位,供試品部位,對(duì)照部位,頭部,尾部,結(jié)果觀察 在除去敷貼物后1h、24h、48h和72h記錄各接觸部位情況。如存在持久性損傷有必要延長(zhǎng)觀察時(shí)間,

8、 以評(píng)價(jià)這種損傷的可逆性或不可逆性,但延長(zhǎng)期不必超過(guò)14d。 按下表規(guī)定的分類(lèi)系統(tǒng), 描述每一接觸部位在每一規(guī)定時(shí)間內(nèi)皮膚紅斑和水腫反應(yīng)情況并評(píng)分, 記錄結(jié)果以出具試驗(yàn)報(bào)告。,注: 記錄并報(bào)告皮膚部位的其他異常情況。,表14 觀察損傷情況及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),表15皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià),結(jié)果評(píng)價(jià),按下列規(guī)定確定原發(fā)性刺激指數(shù)(PII)。 將每只動(dòng)物在每一規(guī)定時(shí)間試驗(yàn)材料引起的紅斑與水腫的原發(fā)性刺激記分相加后再除以觀察總數(shù)(總數(shù)為

9、6:2個(gè)計(jì)分類(lèi)型和3個(gè)觀察期)。當(dāng)用0.9％氯化鈉注射液對(duì)照時(shí)，計(jì)算出對(duì)照原發(fā)性刺激記分，將試驗(yàn)材料原發(fā)性刺激記分減去該記分，即得出每只動(dòng)物原發(fā)性刺激記分。 使用24h、48h和72h的觀察數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。試驗(yàn)之前或72h后的恢復(fù)觀察數(shù)據(jù)不用于計(jì)算。 每只動(dòng)物的記分相加后除以動(dòng)物總數(shù)即為原發(fā)性刺激指數(shù)。,皮內(nèi)刺激試驗(yàn),簡(jiǎn)述評(píng)價(jià)材料通過(guò)皮內(nèi)注射浸提液產(chǎn)生刺激反應(yīng)的潛在性。 應(yīng)排除的試驗(yàn)材料任何對(duì)皮膚、眼、粘膜組織有刺激

10、的材料或產(chǎn)品, 如具有腐蝕性的強(qiáng)酸或強(qiáng)堿材料(pH≤2或≥11.5)不應(yīng)再進(jìn)行本試驗(yàn)。,試驗(yàn)材料與儀器,天平 精度 0.01或0.1g 供試品稱(chēng)量用精度 0.1或1mg 試劑稱(chēng)量用精度 50g 試驗(yàn)用兔稱(chēng)量用兔固定裝置、手術(shù)剪刀、推子、稱(chēng)量瓶、吸管、移液管、注射器（2mL）、注射針（5＃、8＃）、燒杯、壓力蒸汽滅菌器。,試劑75%

11、(V/V)乙醇、0.9％氯化鈉注射液、植物油或其它規(guī)定的溶劑。器具滅菌與供試品接觸的所有器具應(yīng)采用可靠的方法滅菌，置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃恒溫20分鐘，或置電熱干燥箱內(nèi)160℃干烤2h。供試品制備根據(jù)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定制備供試品。,試驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)使用清潔級(jí)健康、初成年的、未使用過(guò)的試驗(yàn)用（新西蘭）兔，雌雄兼用, 同一品系,同一飼養(yǎng)條件 體重不低于2kg。預(yù)試驗(yàn)試驗(yàn)材料初試至少采用2只動(dòng)物。初試反應(yīng)如可疑或不明確, 應(yīng)考慮進(jìn)行復(fù)

12、試。,試驗(yàn)步驟,試驗(yàn)前一天，將試驗(yàn)用兔人工固定或固定到固定裝置上，然后把背部脊柱兩側(cè)的被毛用手術(shù)剪粗剪后再用推子小心的把被毛去除干凈(約10cm×20cm區(qū)域),作為試驗(yàn)和觀察部位。去毛過(guò)程應(yīng)確保動(dòng)物皮膚健康無(wú)損傷。試驗(yàn)前用75％的(V/V)乙醇擦拭背部去毛區(qū)域，等變干后再進(jìn)行注射。在每只兔脊柱左側(cè)上面5個(gè)點(diǎn)(見(jiàn)下圖)用注射器皮內(nèi)注射0.2mL0.9％氯化鈉注射液制備的浸提供試液。在每只兔脊柱左側(cè)的下面五個(gè)點(diǎn)(見(jiàn)下圖)

13、用注射器皮內(nèi)注射0.2mL 0.9％氯化鈉注射液對(duì)照液。在每只兔的脊柱右側(cè)上面五個(gè)點(diǎn)(見(jiàn)下圖2)用注射器注射0.2mL植物油制備的浸提供試液，右側(cè)下面五個(gè)點(diǎn)用注射器注射0.2mL植物油對(duì)照液。,,注：有時(shí)我們應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)材料的粘性選用不同規(guī)格的注射針頭做皮內(nèi)注射。在不妨礙注射的前提下，應(yīng)盡量選用小號(hào)針頭。,24小時(shí)觀察,結(jié)果觀察,注射后即刻和24h、48h和72h后觀察記錄各注射部位狀況。 按下表給出的分類(lèi)系統(tǒng)對(duì)每一觀察期各注射部

14、位的紅斑（ER）和水腫(ED)的組織反應(yīng)評(píng)分,并記錄試驗(yàn)結(jié)果。油類(lèi)液體皮內(nèi)注射常會(huì)引起炎癥反應(yīng)。在72h觀察時(shí), 可靜脈注射適宜的活體染料, 如臺(tái)盼藍(lán)或伊文思藍(lán), 以顯示出刺激區(qū)域有助于反應(yīng)評(píng)價(jià)。,結(jié)果評(píng)價(jià),按下列方法確定刺激指數(shù)。將每只動(dòng)物在每一規(guī)定時(shí)間內(nèi)每種浸提液出現(xiàn)的紅斑與水腫的刺激記分相加,再除以觀察總數(shù)為試驗(yàn)材料刺激記分。對(duì)試劑對(duì)照注射部位也同樣評(píng)價(jià)。將試驗(yàn)材料刺激記分減去試劑對(duì)照的記分得出每只動(dòng)物刺激記分, 用于計(jì)算