第二章細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備和操作技術(shù)2

1、第二章 細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備和操作技術(shù),1、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)和基本操作技術(shù) 2、培養(yǎng)基及其配制,一、 實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì),細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室它必須滿足三個(gè)基本的需要，即： ?實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（培養(yǎng)基配制，洗滌與滅菌）； ?無菌操作； ?控制培養(yǎng)。,從總體上來分，實(shí)驗(yàn)室主要分為兩類： ?基本實(shí)驗(yàn)室： ?輔助實(shí)驗(yàn)室：,實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì),1、基本實(shí)驗(yàn)室： ?準(zhǔn)備室 ?接種室

2、 ?培養(yǎng)室,? 作用 植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)所需器具的洗滌、干燥和保存；培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌；化學(xué)試劑的配制；重蒸餾水的生產(chǎn)等。? 設(shè)計(jì)要求 面積20m2左右。通風(fēng)透光，地面防滑，墻面防潮。,準(zhǔn)備室,▲ 實(shí)驗(yàn)臺架 ▲ 大、小水槽▲ 烘箱 ▲ 冰箱▲ 天平系列 ▲ pH計(jì)▲ 高壓消毒鍋 ▲ 各種玻璃器皿▲ 藥品柜 ▲（

3、磁力）攪拌器▲ 電爐 ▲ 蒸餾水器,? 設(shè) 備,其中：玻璃器皿包括三角瓶、試管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、燒杯、量筒、移液管等 ▲移液槍（根據(jù)條件需要）由槍和槍頭組成▲其他：鍋、微波爐等,磁力攪拌器,電子天平,pH計(jì),接種室 ——也叫無菌操作室無菌操作室并非無菌，但應(yīng)該保持清潔? 作用 供外植體的接種，培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移和原生質(zhì)體的游離培養(yǎng)操作之用。,

4、無菌室,? 設(shè)計(jì)要求 墻壁光滑平整，地面平坦無縫，除出入口和通氣口外，應(yīng)當(dāng)密閉，空氣不能對流，或者空氣經(jīng)凈化后進(jìn)入室內(nèi)。 無菌室旁邊應(yīng)設(shè)有緩沖間，緩沖間內(nèi)應(yīng)有紫外燈，隨時(shí)可進(jìn)行滅菌。,無菌室內(nèi)的日常滅菌：定期用甲醛和高錳酸鉀混合后熏蒸，產(chǎn)生大量蒸汽，殺滅微生物。 使用前處理：用新潔爾滅（1：50）擦凈，然后用紫外燈照射滅菌至少20分鐘，操作前用70%酒精噴霧。,? 設(shè) 備,△ 紫外

5、光燈△ 空調(diào)△ 放物架（或醫(yī)用小平車：推送、放置培養(yǎng)基用；）△無菌操作用的器具：酒精燈、70%酒精消毒棉、解剖刀、弓背鑷子、解剖針、剪刀等。,△ 超凈工作臺： 內(nèi)設(shè)紫外燈、吹風(fēng)裝置、過濾裝置等 每次實(shí)驗(yàn)前要用紫外燈滅菌20分鐘以上，然后噴酒精滅菌，工作過程中注意一直開著吹風(fēng)機(jī)，并且一定要關(guān)掉紫外燈，過濾網(wǎng)應(yīng)經(jīng)常清洗。,其它部件：△離心機(jī)：分離原生質(zhì)體用；△點(diǎn)融合儀：細(xì)胞融合用。,3 培養(yǎng)室,離體組織和試管苗生長發(fā)育的

6、場所，應(yīng)為培養(yǎng)物創(chuàng)造適宜的溫、光、氣等條件。? 設(shè)計(jì)要求 培養(yǎng)室內(nèi)要求內(nèi)壁保溫、光滑、室頂高2.6m左右，易于控制溫、濕度，窗上要求裝雙層密封玻璃窗，室內(nèi)有足夠電源。,,? 作用,? 設(shè) 備,△ 空調(diào)機(jī)：冷暖型△ 加熱器△ 定時(shí)裝置：控制光照時(shí)間△ 培養(yǎng)架：放置培養(yǎng)瓶△ 搖床和轉(zhuǎn)床：懸浮培養(yǎng)△ 各種光質(zhì)燈管：光照培養(yǎng)△ 溫度計(jì)：控制溫度△ 遮光簾：供暗培養(yǎng)之用,2、輔助實(shí)驗(yàn)室： ?

7、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室 ?攝影室及暗室 ?生化分析室,細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室,? 主要設(shè)備 各種顯微鏡，顯微照相設(shè)備，切片、制片儀器設(shè)備，染色用具，暗房設(shè)備等。,,? 作 用,植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)過程中，需隨時(shí)觀察記錄其細(xì)胞學(xué)和形態(tài)解剖學(xué)的變化，故要設(shè)置細(xì)胞顯微觀察室。,,理化分析試驗(yàn)室,細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)備配制小結(jié),?基本設(shè)備：冰箱、天平、酸度計(jì)?滅菌設(shè)備：蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。?無菌操作設(shè)

8、備：凈化工作臺、接種箱,? 光溫控制設(shè)備：時(shí)間程序控制器、空調(diào)及溫度感應(yīng)器。? 細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備：培養(yǎng)設(shè)備根據(jù)需要而定，包括培養(yǎng)架、培養(yǎng)箱、搖床、生物反應(yīng)器等。? 細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備：光學(xué)研究顯微鏡、實(shí)體顯微鏡、倒置顯微鏡,基本操作技術(shù),基本操作技術(shù)主要是圍繞無菌操作技術(shù)展開的一系列操作技能，內(nèi)容主要包括： 一．洗滌技術(shù) 二．滅菌、消毒技術(shù) 三、接種技術(shù),一、 洗滌技術(shù),?、洗滌目的：去除雜物

9、，降低帶菌量?、根據(jù)洗滌對象的不同，主要分為：,器皿洗滌（包括玻璃、塑料、搪瓷、 不銹鋼器皿）,培養(yǎng)材料洗滌,,（一）器皿洗滌,根據(jù)洗滌對象的具體情況可分為以下三種：,特殊洗滌,微生物大量污染的洗滌,常規(guī)洗滌,,? 常規(guī)洗滌,△ 自來水洗去油漬、霉菌等臟物；△ 溫肥皂水中浸泡一定時(shí)間后用刷子刷凈；△自來水沖洗干凈，至瓶壁不掛水珠為止；△ 蒸餾水淋洗內(nèi)外壁△ 將玻璃器皿倒置：晾干或烘干（50

10、～75℃）△ 放入除塵柜中備用,? 微生物大量污染的洗滌 △ 微生物污染器皿加壓滅菌后再洗滌,特殊洗滌（如沾有蛋白質(zhì)類物質(zhì)或其它有機(jī)物時(shí))△ 經(jīng)過常規(guī)洗滌未過蒸餾水的器具，浸泡入洗液（鉻酸洗滌液是用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)與硫酸(H2SO4)配制而成）中數(shù)分至數(shù)小時(shí)； △ 回收洗液，器具先用自來水洗凈，蒸餾水淋洗，烘干（75℃）,（二）、試驗(yàn)材料的清洗 清洗目的：來自自然界的試驗(yàn)材料，包括來自土壤

11、中的幼莖、磷莖，滋生著各種微生物，尤其是細(xì)菌的芽孢和真菌的孢子，一旦與培養(yǎng)基接觸，就會很快的繁殖起來，造成培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的污染。 清洗方法：先用自來水沖洗5分鐘，然后用中性洗滌劑清洗，注意勿損傷試驗(yàn)材料。再用自來水流水沖洗半小時(shí)，用于下一步的藥劑滅菌。,二、滅菌、消毒技術(shù),（一）關(guān)于有菌和無菌的概念 有菌的范疇：,,凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的，如植物的表面、超凈工作臺的臺面，未處理的工具和手等。,

12、高壓高溫處理（工具、器皿、培養(yǎng)基等） 物理或化學(xué)處理； 火烤后的物體； 健康的動植物不與內(nèi)外部表面接觸的組織 內(nèi)部可能是無菌的（有時(shí)也有內(nèi)生菌，但 不會影響培養(yǎng)，也不會污染）,,無菌的范疇：,,,,,,（二）滅菌、消毒技術(shù)作用和意義 植物組培中，凡用于培養(yǎng)和無菌操作的房間、器具、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基，培養(yǎng)材料和操

13、作者的衣物和手都應(yīng)隨時(shí)進(jìn)行滅菌，以確保不受雜菌污染，否則，由于雜菌的生長繁殖速度一般都比培養(yǎng)的組織快得多，最終將把組織全部殺死，這些污染微生物還可能排泄對植物組織有毒的代謝廢物，因此在培養(yǎng)容器內(nèi)部保持一個(gè)完全無菌的環(huán)境是絕對必須的。,（三）滅菌、消毒種類,?物理方法： ?物理滅菌：高溫高壓滅菌（干熱/濕熱）、烘烤或灼燒滅菌、射線處理、超聲波等 ?物理除菌：過濾（0.25微米） 、離心沉淀等；?化學(xué)方法：使用滅菌

14、劑，如薰蒸滅菌、消毒液滅菌（酒精、升汞、苯酚、漂白精、新潔爾滅、次氯酸鈉、過氧化氫）,? 消毒、滅菌的對象： ★ 接種室 ★ 材料（外植體）： 完全殺死材料表面的微生物過程： 洗潔精→酒精→氯化汞等 ★器皿用具消毒（滅菌） ★ 培養(yǎng)基,（三）、培養(yǎng)基、器具的滅菌 用滅菌鍋滅菌：一般121℃，滅菌20分鐘。自動鍋：加足水后，調(diào)好時(shí)間、溫度、即可自動運(yùn)轉(zhuǎn)。 手動鍋:加足水后，關(guān)好，通電。待

15、壓力升到0.5kg／c㎡時(shí)，打開排氣閥排除鍋內(nèi)的冷空氣。然后關(guān)閉排氣閥，升至1.1kg／ c㎡(121 ℃左右)時(shí)計(jì)時(shí)，用通電、斷電來保持20分鐘。待降至壓力為0時(shí)取出。 器具的滅菌：也可用烘箱160 ℃，90～120分鐘,,,,（四）、過濾除菌 培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些激素GA3、玉米素等），就需要過濾滅菌或者兩者結(jié)合。另外酶等也需要過濾滅菌； 滅菌方法：將激素或

16、酶配成一定濃度，用注射器過慮，0.2－0.25微米。配制培養(yǎng)基時(shí)，先將培養(yǎng)基高壓滅菌，待溫度降至50℃左右時(shí)，加入適量的已過慮除菌的激素等，然后分裝。,（五）、外植體的選擇與消毒：,1、外植體的選擇 選擇優(yōu)良的基因型：蔬菜等作物、花卉等觀賞植 物等的脫毒快繁選優(yōu)良種。 取材：從生長旺盛、健壯、無病蟲害的植株上取 材。母柱代謝旺盛期竊取的外植體再生能力強(qiáng)， 試驗(yàn)容易成功

17、。 外植體大小選擇：如利用莖尖培養(yǎng)，脫毒快繁， 莖尖大小對脫毒效果非常明顯。再如幼胚培養(yǎng)， 胚齡也非常重要。 選擇外植體的時(shí)期,,,,,2、外植體的消毒：,取材 將老的組織去掉 自來水沖洗 洗衣粉水洗（簡單殺菌） 自來水沖洗 70％酒精處理 消毒劑處理

18、 滅菌蒸餾水沖洗3－5遍。,,,,,,,,消毒時(shí)間，因材料老嫩程度不同有所不同。一般，較老的材料相對殺菌時(shí)間較長，反之，較短。一般殺菌，酒精10秒，升汞5－12分鐘。,,外植體在接種之前，須經(jīng)嚴(yán)格的滅菌。與此同時(shí)，又要注意不損傷外植體。不同滅菌藥劑殺菌力不同，故在使用不同的藥劑時(shí)，需要考慮使用濃度和處理時(shí)間，對不同植物種類的不同外植體，處理也有不同。另外，外植體在進(jìn)入消毒劑之前，應(yīng)認(rèn)真取材及清洗，盡可能地減少其帶菌量。,外

19、植體除菌注意事項(xiàng)：,消毒劑 使用濃度(％) 消毒時(shí)間(分) 效果 殘液去除難易次氯酸鈣 10 5～30 好 易次氯酸鈉 2～5 5～30 好 易新潔爾滅 10～20 5～30 好 易氯化汞 0.1～1 2～10 最好 最難過氧化氫 10～12 5～15 較好 最易抗

20、菌素 4～50mg/L 30～60 較好 較難,幾種常用消毒劑的效果比較,,,,,,,,,,,,,,,附：常用消毒劑的性質(zhì),70～75％酒精： 具有較強(qiáng)的穿透力和殺菌力，常作為表面滅菌的第一步，它具有浸潤和滅菌的雙重作用，但不能徹底滅菌，必須結(jié)合其他藥劑滅菌。一般處理時(shí)間為5～30s。為了提高乙醇的殺菌效果，可在乙醇溶液中加入0.1％的酸或堿，因?yàn)镠+和OH-可改變細(xì)胞膜帶電荷的性質(zhì)而使透性增加，提高殺菌的效果

21、,升汞（HgCl2）： 劇毒的重金屬鹽殺菌劑，其殺菌原理是Hg2＋與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使菌體酶蛋白變性失活。使用濃度0.1～0.2％，一般浸泡處理6～12min就可有效地殺死附著在外植體表面的細(xì)菌及真菌，滅菌效果極好。但用升汞滅菌的外植體材料須用無菌水反復(fù)多次沖洗，才能洗去殘留的汞，否則會對外植體產(chǎn)生毒害作用。通常用無菌水沖洗不得少于5次。由于升汞的毒性劇烈，使用中務(wù)必注意安全。,升汞廢物的處理,升汞為劇毒藥品，

22、一則使用時(shí)注意別濺到皮膚上，二則使用后要進(jìn)行處理，不能直接倒入下水道。,升汞處理方法：,升汞＋Na2S,絮狀沉淀（至絮狀沉淀不再產(chǎn)生為止）,＋FeSO4（中和過多的Na2S ）,,,,,次氯酸鈉（NaClO）： 用市售的“安替福民”配制2～10％的NaClO，滅菌時(shí)間5～30min，無菌水沖洗4～5次。由于它分解出具殺菌作用的氯氣，滅菌處理后易于除去，無殘留，既有較強(qiáng)的殺菌力，又對植物無害，是常用的殺菌劑。,過氧化氫（

23、雙氧水）： 常用6～12％的溶液處理外植體材料，滅菌效果較好，由于該藥劑在外植體表面容易除去，又不會損傷外植體，通常用于葉片材料的滅菌。,新潔爾滅： 一種廣譜的表面活性滅菌劑。它對絕大多數(shù)植物外植體傷害很小，滅菌效果很好。通常使用1：200稀釋液，處理30min或更長。,在用上述藥劑進(jìn)行材料的滅菌處理時(shí)，為了使殺菌劑濕潤整個(gè)組織，有時(shí)還需在藥液中加入潤濕劑。如加入數(shù)滴或0.1％的吐溫（Twee

24、n）80或吐溫20，或者用磁力攪拌、超聲振動等方法使殺菌劑充分接觸外植體，以利于徹底滅菌。,三、接種技術(shù),1所有的消毒、接種等無菌操作技術(shù)均需在無菌室的超凈工作臺上進(jìn)行。 1、超凈工作臺： 內(nèi)設(shè)紫外燈、吹風(fēng)裝置、過濾裝置等，每次實(shí)驗(yàn)前要用紫外燈滅菌20分鐘以上，然后噴酒精滅菌，工作過程中注意一直開著吹風(fēng)機(jī)，并且一定要關(guān)掉紫外燈，過濾網(wǎng)應(yīng)經(jīng)常清洗。 2、無菌操作用的器具：刀、鑷子、剪刀、酒精燈等事先已滅菌，使用中避

25、免交叉污染；3、操作人員在操作之前洗手、換工作服、雙手消毒再操作。,培養(yǎng)條件 ?光照:光照強(qiáng)度、光質(zhì)、光照時(shí)間 ?溫度 ?濕度 ? pH值：5.5～6.5 ?滲透壓 ?通氣條件,根據(jù)離體培養(yǎng)的營養(yǎng)需求，培養(yǎng)基至少包括： ?無機(jī)鹽； ?有機(jī)化合物； ?生長調(diào)節(jié)劑,三、 培養(yǎng)基及其配制,培養(yǎng)基的基本成分,Fe、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、B,1 無

26、機(jī)營養(yǎng)物質(zhì),?、大量元素：,C、H、O,N、P、K、Ca、Mg、S、(Na),?、微量元素：,無機(jī)鹽的作用：,? 一是組成各種化合物，參與機(jī)體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；? 二是構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，如植物激素、酶以及酶的活化劑，參與植物的代謝活動；? 三是這些元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等生物電化學(xué)方面的作用；? 四是在發(fā)育過程中，影響組織器官的建成。,濃度：2%-3%,2 有機(jī)物質(zhì),?糖：,作用：,

27、維持培養(yǎng)基合適的滲透壓為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量,種類：蔗糖、葡萄糖 麥芽糖、果糖等 多糖：可溶性淀粉,?維生素： 硫胺素(VB1)、煙酸（VB3又稱VBPP ） 、泛酸(VB5)、吡哆醇(VB6)、酸銨、鈷胺素(VB12)、葉酸(VM又稱VB11)、抗壞血酸(VC)等等.,作用：利于細(xì)胞代謝和器官分化。 B1是植物組培必須加入的維生素，其用量在0.1-30 mg/L

28、之間，當(dāng)組培中細(xì)胞分裂素特別少時(shí)，B1更為需要；煙酸和B6可促進(jìn)細(xì)胞生長,?氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、 天冬酰胺、丙氨酸等等。因培養(yǎng)基的種類不同，其添加種類和 濃度不同。?肌醇：又稱環(huán)己六醇，促進(jìn)糖類的相互轉(zhuǎn)化、維生素、 激素的利用作用，使培養(yǎng)物快速生長 。?腺嘌呤、硫酸鹽等激素：加入培養(yǎng)基時(shí)，可促進(jìn)芽、根的形成和生長。根 據(jù)培養(yǎng)基的植物不同，決定是否添加。,?瓊脂:是從海藻中提取的一種高分子碳 水化合

29、物，其主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下凝固，但不參與代謝。 ?活性炭:主要目的是利用其吸附能力，減少一些有害物質(zhì)的影響，如可以防止酚類物質(zhì)污染而引起組織褐化死亡。,3、附加物,這類物質(zhì)為非植物細(xì)胞生長所必須，但對細(xì)胞生長有利,主要包括瓊脂和活性炭。,? 作用：提供一些必要的微量營養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長激素等。? 這類物質(zhì)常指天然提取物 ： ?麥芽提取物、 ?椰乳、 ?鮮果汁、

30、 ?酵母提取物,4、 其它有益有機(jī)添加物或未知復(fù)合成分,5、pH值： 即酸堿度，培養(yǎng)的植物材料大多數(shù)要求弱酸性的環(huán)境，一般將培養(yǎng)基調(diào)整至pH5.6—5.8。常用0.1mol/l氫氧化鈉或鹽酸來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。注意： 第一、經(jīng)高溫高壓滅菌后，培養(yǎng)基的pH會下降0.2-0.8,故調(diào)整后的pH應(yīng)該高于目標(biāo)pH 0.5個(gè)單位; 第二、 pH的大小會直接影響到瓊脂的凝固能力，一般pH 大于6.0時(shí)，培養(yǎng)基就

31、會變硬，低于5.0時(shí)瓊脂就不能很好地凝固,6、激素,?在培養(yǎng)基中，其各種成分對培養(yǎng)物影響最大的最顯著的就是激素。激素的種類、濃度、以及配比都會顯著的影響愈傷組織的形成、不定根、不定芽的分化，胚狀體的形成等； ? 組織培養(yǎng)中使用的激素有的是天然的，如脫落酸（ABA）等，有的是合成的，如二氯苯氧乙酸（2，4－D）。,（一）、激素的種類,1、生長素,2、細(xì)胞分裂素,3、赤霉素,4、脫落酸,,1、生長素類,? 生長素是指能引起完整組織中的細(xì)胞

32、擴(kuò)展的化合物。 ?在自然界中，即內(nèi)生生長素影響莖和莖節(jié)的伸長、向性、頂端優(yōu)勢、葉片脫落和生根等現(xiàn)象 ? 在組織培養(yǎng)中的主要作用是：誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞脫分化，促進(jìn)細(xì)胞的伸長，促進(jìn)生根。,? 組織培養(yǎng)中常用的生長素有： 二氯苯氧乙酸（2，4－D） ； 萘乙酸（NAA） 吲哚乙酸（ IAA ） ； 吲哚－3－丁酸（IBA） 萘氧乙酸（NOA） ； 對

33、氯苯氧乙酸（P-CPA） 三氯苯氧乙酸（2，4，5 －T）； 生根粉（ABT） NAA 、IAA、 IBA易引起生根， 2，4－D 、2，4，5 －T有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長。,?主要作用：是誘導(dǎo)愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生以及試管苗的生根，更重要的是配合一定比例的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)腋芽及不定芽的產(chǎn)生；?作用的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?2，4-D>NAA>IBA>IAA,?溶

34、解方法： 0.1M NaOH或95％酒精，以前者為好 ?保存： 配成一定濃度后，冰箱冷藏保存,2、細(xì)胞分裂素 ?自然界中，細(xì)胞分裂素影響細(xì)胞分裂，頂端優(yōu)勢的變化和莖的分化等； ? 組織培養(yǎng)中，細(xì)胞分類素主要促進(jìn)細(xì)胞分裂和愈傷組織上或器官上分化不定芽，葉片擴(kuò)大和莖長高，抑制根的生長。細(xì)胞分裂素常常與生長素相互配合，用以調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，細(xì)胞伸長，細(xì)胞分化和器官形成。,常用的細(xì)胞分裂素有：,? 6－芐基嘌呤（B

35、AP） ； ? 6－芐基腺嘌呤（6－BA）； ?激動素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT）； ?玉米素（ZT）； ?異戊烯氨基嘌呤（2－IP） ?噻二唑苯基脲（ thidiazuron、 TDZ ）； ?溶解方法：0.1MHCL ?保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存,?主要作用：促進(jìn)細(xì)胞的分裂和器官的分化、延緩組織的衰老、增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成、抑制頂端優(yōu)勢、促進(jìn)側(cè)芽的生長及顯著改變其他的激素作用；?作用

36、的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篫T>2-iP>6-BA>KT。,3、赤霉素,赤霉素能夠打破休眠、促進(jìn)果實(shí)成長等效果；赤霉素有20多種，其中在組織培養(yǎng)中最常用的是GA3；已經(jīng)用于頂端分生組織的培養(yǎng)和維管分化的研究；能刺激不定胚發(fā)育成正常小植株；在培養(yǎng)基中很少添加，因?yàn)樗淖饔猛秦?fù)面的。,?溶解方法：95％酒精 ?保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存； 赤霉素易溶于水，但溶于水后不穩(wěn)定，容易分解； ?滅菌：高溫分解，過

37、濾滅菌。,4、脫落酸,?脫落酸能阻礙發(fā)育、促進(jìn)老化、形成休眠芽等作用；?加上脫落酸能抑制生長，是繼代培養(yǎng)時(shí)間延長；?溶解方法：95％酒精；?保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存。,（二）、常見培養(yǎng)基中植物激素配方類型,（三）、常見生長調(diào)節(jié)劑及主要性能一覽表,（四）、常見生長調(diào)節(jié)劑的微摩爾/升濃度與毫克/升的換,三、常用培養(yǎng)基的種類、配方及其特點(diǎn)（一）、培養(yǎng)基的種類 1、培養(yǎng)基，根據(jù)其態(tài)相不同分為固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基。固體

38、培養(yǎng)基是指加凝固劑的培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基是指不加凝固劑的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基加入一定量的凝固劑，加熱溶解后，分別裝入常用的培養(yǎng)基中冷卻后即得到固體培養(yǎng)基。 2、根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程，培養(yǎng)基分為初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基。初代培養(yǎng)基是指用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基是指用來接種繼初代培養(yǎng)基之后的培養(yǎng)物的培養(yǎng)物。,3、根據(jù)其作用不同，培養(yǎng)基分為誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。 4、根據(jù)其營養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為基本培

39、養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基（就是通常稱呼的培養(yǎng)基）主要有MS、White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、 Miller等。完全培養(yǎng)基就是基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)等。,（二）幾種常見培養(yǎng)基： MS、N6、B5、LS、RM-1964、H、T、B5、DBMⅡ、米勒、改良懷特、尼特、努森C等。 MS培養(yǎng)基是目前應(yīng)用最多最普遍的培養(yǎng)基。無機(jī)鹽的濃

40、度較高，能保證組織培生長所需的礦物質(zhì)營養(yǎng)。并且因?yàn)殡x子濃度高，在配制、貯存、消毒過程中，即使有些成分略有出入，也不致影響培養(yǎng)基中的離子平衡,四、培養(yǎng)基的配制 （一）、貯備液（母液）的配制為什么要配制母液？ 1）、方便 2）、準(zhǔn)確（有些成分量太小） 3）、母液要分類配， 否則有些成分混合一起會產(chǎn)生沉淀 以MS培養(yǎng)基為例：,表1－1MS培養(yǎng)基母液的配制,?貯備液Ⅰ（大量元素） 10倍?貯備液

41、Ⅱ（微量元素） 100－1000倍?貯備液Ⅲ （鐵鹽） 100－1000倍?貯備液Ⅳ （有機(jī)成分） 100倍?母液Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ按表稱量藥品－溶解－定容－冰箱冷藏?母液Ⅲ，F(xiàn)eSO4.7H2O和Na2.EDTA稱量后，分別溶于水中，加熱，然后混合一起；或者混合一起后加熱，顏色黃色變深，生成Fe.EDTA ,冷卻后，冰箱冷藏。,,（二）、培養(yǎng)基的配制1、向燒杯加入適量的水，按量加入4種貯備液（母液）2、按所

42、需濃度加激素，或其他成分，如AgNO3等3、加蔗糖，一般30g/L4、pH值測定 pH值測定儀，NaOH、HCl，1M、0.1M調(diào)整5、加瓊脂 ，一般6－8g/L，溶化（電爐、微波爐等）6、分注、封口（鋁箔紙，牛皮紙、塑料紙等）7、滅菌 121℃，20－25分鐘（并不是滅菌時(shí)間越長越好，滅菌時(shí)間過長會導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)的某些成分變性失效）,滅菌后，應(yīng)盡快地轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶使其冷卻，一般應(yīng)將滅菌后的培養(yǎng)基儲藏于30℃以下的室內(nèi)名，最好儲