結核感染t細胞檢測及意義

1、Υ干擾素釋放試驗（IGRAs）臨床應用,南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 呼吸科沈 紅,1. 結核病的診斷現(xiàn)狀,2. TB-IGRA產(chǎn)品介紹,3. TB-IGRA的臨床應用,4. TB-IGRA檢測方法及結果解釋,,3,結核病現(xiàn)狀,結核病(tuberculosis)是由結核分枝桿菌(tubercle bacillus)引起的一種慢性肉芽腫性炎。以肺結核最常見，死亡人數(shù)僅次于艾滋病。也可見于全身各器官。肺外結核占整個發(fā)病率的10%-20%，死

2、亡率占結核病全部死亡率的14.1%-17.6%。全世界約三分之一的人群感染，《2014年全球結核病報告》顯示：2013年有900萬新發(fā)病例， 150萬人死亡。中國是結核病高發(fā)區(qū)，發(fā)病數(shù)居全球第二，現(xiàn)有600萬活動性肺結核，且患者人數(shù)逐年增加，始終位居全國甲乙類傳染病的前列。,電鏡下的結核桿菌,World Health Organization.Global tuberculosis control:epidemiology,stra

3、tegy, financing:WHO report 2011(WHO/HTM/TB/2011.16).Geneva:WHO,2011,2010年新發(fā)880萬例結核患者，59%在亞洲，26%在非洲,發(fā)病人群前五位的國家,India(2.0 million–2.5 million) (26%) China (0.9 million–1.2 million)South Africa (0.40 million–0.59 million)

4、Indonesia (0.37million–0.54 million) Pakistan (0.33 million–0.48million).,,38%,結核病現(xiàn)狀及危害-傳播范圍廣,World Health Organization.Multidrug and extensively drug-resistant TB (M/XDR-TB): 2010 global report on surveillance and res

5、ponse. WHO/HTM/TB/2010.3.,逐年增加,全球27個MDR-TB流行嚴重的國家之一，中國尤其嚴重,HIV 感染和艾滋病破壞了機體的免疫系統(tǒng)，加劇了結核的發(fā)病， 1/3HIV病人死于結核 多菌耐藥的結核菌感染率增加 貧困、移民等 細菌學涂片率低，2/3TB病人菌陰性,原 因,結核發(fā)病機理,結核分枝桿菌（MTB）,暴露,,感染,,9%,復燃,注：感染后發(fā)病與否和機體易感性有關！,5-1

6、0%,HIV>10%,,治愈,,活動性結核： 發(fā)病狀態(tài)潛伏性結核感染（LTBI）：是宿主感染結核桿菌后尚未發(fā)病的一種特殊狀態(tài),未根治,結核病的免疫主要是細胞免疫,,,Dheda K, et al.The immunology of tuberculoisis:From bench to beside.Respirogy,2010,15:433-450,11,耗時長4-8周檢出率低50%涂陰檢出低22%-38%肺外結核難,結

7、核檢測的方法比較,結核診斷,X射線,分子診斷,涂片鏡檢,細菌培養(yǎng),特異性差誤診肺炎、肺癌肺外結核難,操作復雜技術要求高涂陰檢出低34%肺外結核難,不能區(qū)分NTM檢出率低20%肺外結核難,假陽/假陰多；（涂陰45%/35%）WHO建議禁用,抗體檢測,,TST（結核菌素皮試）,不能區(qū)分卡介苗接種者不能區(qū)分NTM48-72小時復診,接觸史臨床癥狀病原/病理,12,TB-IGRA,Tuberculosis（結核TB

8、）Interferon（干擾素）Gamma（ γ）Release（釋放）Assay（測定）原理: 感染者體內(nèi)被結核菌（TB）抗原致敏的效應T細胞，在體外受到相同抗原的刺激（在APC輔助下）后，會分泌大量IFN- γ(細胞因子)。通過IFN- γ的檢測，判斷結核感染情況。,1. 結核病的診斷現(xiàn)狀,2. TB-IGRA介紹,3. TB-IGRA的臨床應用,4. TB-IGRA檢測方法及結果解釋,,,TB-IGRA方法介紹,ELI

9、SA,ELISPOT,流式細胞術,IGRAsIFN-g release assay,體外刺激：RD1抗原,原理: 機體內(nèi)被結核菌抗原致敏的效應T細胞，在體外受到相同抗原的刺激（在APC輔助下）后，會分泌大量IFN- γ(細胞因子)。通過IFN- γ的檢測，判斷結核感染情況。,兩種TB-IGRA比較,高孟秋,劉菲,紀濱英等.兩種γ-干擾素釋放分析在結核病臨床診斷中的比較研究.中華結核和呼吸雜志，2012，35（10）：762-765,T

10、B-IGRA 產(chǎn)品特性,高靈敏度，檢出率85%以上高特異性RD1區(qū)編碼的ESAT-6和CFP-10兩個特異性抗原該抗原具 有較強的Thl細胞免疫原性，且在所有制備卡介 苗的菌株及環(huán)境中絕大多數(shù)非結核分枝桿菌中均不存在該抗原，不受卡介苗和非分支桿菌影響,國內(nèi)外相關研究,TB-IGRA快速簡便，是一種值得推廣的檢測方法：,,張華，黃圣文，羅振元.結核分枝桿菌r-干擾素體外釋放定量試驗診斷結核感染的臨床應用.中華醫(yī)學院感染學雜志 200

11、9年第19卷第14期,,國內(nèi)外相關研究,1. 結核病的診斷現(xiàn)狀,2. TB-IGRA介紹,3. TB-IGRA的臨床應用,4. TB-IGRA檢測方法及結果解釋,,臨床應用案例,肺結核輔助診斷：某院呼吸科病人，男臨床癥狀：發(fā)熱1周，咳嗽檢測結果：TB-IgG(-)，TB-IGRA（+）T-N的值是21.5pg/ml結果分析：TB-IgG靈敏度低，易漏檢。臨床診斷：肺結核備注：2011年，WHO建議不再使用結核抗體檢測結核感染

12、,臨床應用案例,肺外結核輔助診斷：某院感染科，女，75歲 臨床癥狀：發(fā)熱數(shù)日，胸痛，干咳檢測結果：X射線胸腔積液影像，積液涂片（-）、積液培養(yǎng)（-）、TB-IGRA T-N 350pg/ml，積液單核細胞增多，血沉快結果分析：對于肺外結核的診斷，涂片與培養(yǎng)的陽性率極低，TB-IGRA（+），結合其他非特異輔助指標可明確診斷肺外結核。臨床診斷：結核性胸膜炎,臨床應用案例,肺炎與肺結核的鑒別診斷：某醫(yī)院呼吸內(nèi)科，男，59歲

13、臨床癥狀：肺部有胸水，高燒發(fā)熱，初步認定肺炎，抗生素治療1周不見效果，高度懷疑結核。檢測結果：痰涂片（-），結核抗體（-），TB-IGRA（-）結果分析：傳統(tǒng)結核檢測檢出率在20%-40%，靈敏度低。IGRA檢出率在90％以上，陰性排除意義高于涂片和抗體。患者繼續(xù)用藥3周，病情好轉。臨床診斷：肺炎,23,MTB與其他桿菌感染的鑒別診斷：某院呼吸內(nèi)科病人，男臨床癥狀：發(fā)熱、咳嗽、咳痰、呼吸困難，乏力，多汗，關節(jié)疼痛檢測結果：痰

14、涂片（-），菌培（-），肺部X射線可見肺結節(jié)，胸腔積液診斷過程：該院診斷為結核但治療無好轉，患者轉院檢測IGRAs（-），試管凝集實驗++，布病抗體++，確診布氏桿菌感染，與該院打官司勝訴。結果分析：由于痰涂片和菌培檢出率低，陰性也未能引起重視，只憑X片和癥狀診斷為結核并治療。治療無效后，病人轉院，檢測IGRAs陰性，考慮排除結核，且病人為牧民，確診布氏桿菌病。官司敗訴后，該院才開始重視IGRAs檢測。最終確診：布氏桿菌病,臨床應

15、用案例,MTB與NTM的鑒別診斷：某院感染科病人，男臨床癥狀：發(fā)熱1周，咳嗽，少量痰檢測結果：兩次痰涂片（+），兩次TB-IGRA（-），肺部X射線無異常，后經(jīng)菌培鑒定為菌培（-）結果分析：痰涂片不能區(qū)分非結核分枝桿菌，造成假陽性，而TB-IGRA與菌培結果相符，對結核分枝桿菌有很好的特異性。臨床診斷：鳥型分枝桿菌感染,臨床應用案例,NTM（非結核分枝桿菌）比例增高,2000 年全國流調(diào)分離的抗酸桿菌菌株中，NTM 菌株占11

16、. 1% ，其中90% 為非結核分枝桿菌肺病。NTM 肺病的臨床表現(xiàn)與結核病相似， 既可有全身中毒癥狀，亦有局部損害表現(xiàn)。但癥狀和體征缺乏特異性，20%-50% 的病人無明顯癥狀，除非做菌型鑒定，憑臨床表現(xiàn)難與肺結核病相鑒別。PPD 試驗：弱陽性多見，但不能鑒別MTB和NTM感染。 細菌學檢查：常規(guī)痰涂片無法鑒別MTB和NTM。培養(yǎng)特性：固體培養(yǎng)基上，NTM菌落常光滑，部分菌落有色素產(chǎn)生，生長迅速，且在含PNB(對硝基苯甲酸)和

17、含TCH (噻吩二羧酸肼)選擇性培養(yǎng)基上均可生長，而結核分枝桿菌只在TCH選擇性培養(yǎng)基上生長。,使用抗TNF藥物前排查結核的意義,06.16.2011,26,發(fā)病率 /100.000 患者/年,Dixon W G et al. Ann Rheum Dis 2010;69:522–528.,Tubach et al. Arthritis & Rheum 2009; 60: 1884-1894,發(fā)病率 /100.000 患者/年,

18、潛伏性感染監(jiān)控,某中學高三年級小規(guī)模結核爆發(fā),初始病例,1例（7班）,6月初,第一批疫情,5例（7班）,8-9月,第二批疫情,10例（8例7班）,9月,,,,,,,,,,,,,,對師生采血進行IGRA檢測,,IGRA陽性者進行預防性服藥,疫情控制,自行住院,全年級師生胸透，胸透陰影預防性服藥,全年級師生PPD試驗,疫情發(fā)展階段,結核病例及分布,疫情時間,,疫情初處理,√,一起小規(guī)模結核暴發(fā)流行的調(diào)查與控制,×,潛伏性感染、抗結

19、核治療監(jiān)控,定量檢測γ干擾素釋放強度，可用于持續(xù)監(jiān)控：,抗結核治療效果輔助評估,Kobashi等利用IGRA對50例結核患者的治療進行追蹤檢測：,治療開始后，結核患者中IGRA的敏感性和反應強度均有明顯的下降趨勢,綜上，TB-IGRA： 高特異性，高靈敏性，體外，全血，定量檢測應用方向：肺結核輔助診斷肺外結核輔助診斷結核感染排查潛伏性感染監(jiān)控，抗結核治療追蹤,TB-IGRA的臨床應用,TB-IGRA應用匯總

20、,肺結核的輔助診斷，尤其是細菌學檢測陰性的肺結核的輔助診斷：TB-IGRA從細胞水平上檢測結核感染，檢出率高，早期感染即可檢出，實現(xiàn)早診斷早治療。肺外結核的輔助診斷：TB-IGRA取靜脈血進行檢測，克服肺外結核患者痰樣找不到結核菌，病灶部位取樣難的問題。呼吸系統(tǒng)疾病與結核的鑒別診斷：發(fā)熱、咳嗽、咳痰>2周；咯血；胸痛等癥狀疑似結核，胸片/CT不能明確診斷者；抗炎治療治療效果不佳患者的結核排查，陰性結果在很大程度上可以排除結核。

21、,,2周以上不明原因發(fā)熱病人的結核感染排查：有研究發(fā)現(xiàn)其中20%是結核引起的，大部分是肺外結核。高危人群的結核感染篩查：如使用生物制劑/免疫抑制劑、大劑量激素患者，HIV患者，糖尿病患者，血液病和癌癥放化療之前患者進行結核篩查，以防陳舊性結核、潛伏性結核爆發(fā)以及近期結核感染?？菇Y核治療效果跟蹤以及潛伏性結核定期監(jiān)控：TB-IGRA結果是一個定量值，活動性結核患者隨治療進行陽性強度降低甚至轉陰；潛伏感染患者若發(fā)生陽性強度明顯升高，有發(fā)

22、展成活動性結核風險。流調(diào)顯示有85%～90%新診斷的活動性肺結核由潛伏性結核演變而來。,已有25個國家發(fā)布了IGRAs 應用指南： 美國、加拿大、英國、巴西、法國、西班牙、意大利、德國、澳大利亞、葡萄牙、愛爾蘭、瑞士、丹麥、挪威、芬蘭、捷克、斯洛伐克、波蘭、保加利亞、克羅地亞、沙特、 奧地利、南韓、日本、中國,潛伏性感染和活動性結核的輔助診斷（美國CDC，英國NICE ，中國） 疑似結核的輔助診斷，

23、陰性結果排除感染（中國）在所有人群中可以完全代替PPD試驗（美國CDC，日本厚生?。?接受抗TNF-a治療前必須用IGRA進行結核桿菌感染的篩查，PPD篩查不再使用（瑞士衛(wèi)生署和肺科協(xié)會） 兩個國際組織WHO、ECDC也發(fā)布了應用指南。萬泰TB-IGRA試劑是“中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準—結核分枝桿菌γ-干擾素體外檢測方法”中唯一提到的結核檢測試劑。,1. 結核病的診斷現(xiàn)狀,2. TB-IGRA產(chǎn)品介紹,3. TB-I

24、GRA的臨床應用,4. TB-IGRA檢測方法及結果解釋,,萬泰TB-IGRA,北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司,國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心,廈門大學,,研制歷經(jīng)6年，2012年4月獲得SFDA認證,國食藥監(jiān)械（準）字2012第3400557號,TB-IGRA檢測方法,陰性對照管N,陽性對照管P,檢測管T,培養(yǎng)液無刺激原,培養(yǎng)液刺激抗原,培養(yǎng)液PHA,TB特異性刺激抗原（RD1區(qū)：ESAT-6、CFP-10）,無刺激效

25、應,非特異性刺激抗原（PHA）,評估γ-IFN升高水平,評估γ-IFN本底水平,評估T淋巴細胞活性,,,,,,,,,,,,ELISA定量分析,TB-IGRA結果判定,T：測試培養(yǎng)管（T）含量值N：本底對照培養(yǎng)管（N）含量值P：陽性對照培養(yǎng)管（P）含量值,TB-IGRA結果判定,全自動酶免平臺系統(tǒng),,,TB-IGRA注意事項,采血管推薦使用BD或Greiner Bio-One肝素鋰采血管，內(nèi)毒素最少，對結果影響最小采血到分裝不超過4

26、小時，避免混血激烈/溶血等病人情況 免疫系統(tǒng)異?；颊邫z出效果受限不能嚴格區(qū)分活動或潛伏無癥狀陽性的處理 依據(jù)下一步治療和病人意愿做預防性治療不確定結果的原因 免疫系統(tǒng)異?；颊呷菀滓蛎庖吡Φ拖禄颚酶蓴_素本底過高造成無法判斷,TB-IGRA的臨床參考,萬泰TB-IGRA檢測試劑盒的優(yōu)勢,高靈敏度：肺內(nèi)、肺外結核輔助診斷，尤其可用于涂/菌陰肺結核的輔助診斷；高特異性：排除卡介苗及非結核分枝桿菌的干擾，降低假陽性

27、；體外全血檢測：有效檢出肺外結核，并發(fā)現(xiàn)早期感染者；定量分析：可進行療效的輔助評估；采用酶免平臺，具有高通量檢測能力，簡便快捷，無需對技術人員進行專業(yè)培訓。,2013年6月,TB-IGRA開展情況,TB-IGRA在國內(nèi)開展的單位已有近300家華西醫(yī)院、安貞醫(yī)院、解放軍309醫(yī)院、301醫(yī)院、北京佑安醫(yī)院、湖南省人民醫(yī)院、四川省人民醫(yī)院、西安交大附屬二院等等江蘇目前已開展20多家南京軍區(qū)總醫(yī)院、江蘇省人民醫(yī)院、江蘇省中醫(yī)