腺病毒表達系統(tǒng)

1、腺病毒表達系統(tǒng),質粒型表達載體,病毒型表達載體,真核生物細胞常用的表達載體,,,腺病毒表達載體逆轉錄病毒表達載體昆蟲桿狀病毒表達載體,,病毒表達系統(tǒng)的特點,高轉染效率高蛋白表達水平對轉染效率很低的細胞進行高效轉染 (原代細胞等)穩(wěn)定,可遺傳的表達 (逆轉錄病毒)可控制拷貝數,如何選擇合適的病毒表達載體？,可適用的宿主細胞類型選擇標記插入片段的大小調控元件報告基因,病毒表達載體的用途,基因治療1990年French等

2、把腺嘌呤脫氨酶基因導入到一名4歲小女孩的T淋巴細胞中治療了腺嘌呤脫氨酶基因缺失病,開創(chuàng)了人類利用人體基因治療疾病的先例。1992年復旦大學薛京倫等首次把人凝血因子Ⅸ基因成功用于治療血友病。2005年第一個批準上市的基因治療制品Adv-P53在中國上市。病毒載體疫苗,重組腺病毒的作用,在哺乳動物細胞中，AdV已被成功應用于表達各種病毒和細胞的基因，腺病毒表達載體系統(tǒng)表達出蛋白的生物化學特性，可用于商業(yè)價值的開發(fā)，它可用來生產亞單位疫

3、苗，和新型診斷試劑盒的開發(fā)。AdV可以通過轉染細胞來表達蛋白，除基因治療的相關實驗外還可用做體內特性研究。,被注射Ad5.CMV-LacZ的大鼠脊髓,純化腺病毒的電子顯微照片,被注射Ad5.CMV-GFP的大鼠紋狀體的切片,用AdV轉染基因的優(yōu)點,速度快，簡單，不需要任何特殊的裝備。相對其它方法，它非常容易被接受。事實上，這種感染后細胞生存率幾乎為100%。因此，AdV有向細胞內轉染遺傳物質而忽視毒性作用的能力。許多細胞類型均可被

4、轉染。感染后的數小時，基因表達便可被分析。刺激后，可有一種以上的基因被同時表達。,腺病毒顆粒比較穩(wěn)定,病毒基因組較少發(fā)生重排。插入外源基因的病毒基因組在連續(xù)傳代中一般保持不變。腺病毒基因組較易操作。制備大量的腺病毒較為容易?？筛腥痉至鸭毎头欠至鸭毎Ads可轉導肺細胞、肝細胞、骨細胞、血管、肌肉、腦、中樞神經系統(tǒng)等。,重組腺病毒表達系統(tǒng),重組腺病毒表達系統(tǒng),通過對本體蛋白的同樣的翻譯后的修飾，在細胞中表達真核蛋白。 一系

5、列腺病毒轉換因素允許產生高水平的異種蛋白。重組蛋白代表了整個細胞蛋白的最豐富的多肽（20%-30%）。在較好的條件下，表達系統(tǒng)在數升的293細胞懸浮培養(yǎng)液中可以按比例地增加，產量可達90mg/L。,腺病毒表達系統(tǒng),腺病毒屬于無包膜病毒,外殼由240個六鄰體和12個五鄰體構成二十面體結構,內部有約36kb的線性雙鏈基因組,屬于DNA病毒。外殼的五鄰體分別位于二十面體結構的頂角、均有一個纖突蛋白(fiber)突起與其相連,腺病毒的組織親合

6、性與纖維蛋白頭部密切相關。,腺病毒的特性,腺病毒基因組編碼數十個腺病毒的結構和功能蛋白,分為早期表達和晚期表達。早期表達的蛋白是功能蛋白、晚期表達的有功能蛋白和結構蛋白,并且早期的功能蛋白調控晚期蛋白的表達。早期表達的Ｅ1區(qū)蛋白(甚至包括Ｅ2區(qū)蛋白)是腺病毒基因組復制、病毒包裝和其他蛋白表達翻譯所必需的,但其對細胞的毒性也是很強的。E2蛋白涉及AdDNA復制, E3蛋白對抗宿主的抗病毒防御系統(tǒng), E4調節(jié)有效的晚期基因轉錄。,腺病毒的基

7、因及其功能,腺病毒感染細胞的第一步是通過纖突蛋白與細胞表面柯薩奇病毒和腺病毒受體(CAR)結合。腺病毒粘附后,五鄰體蛋白上的精氨酸-谷氨酸-天門冬氨酸（ＲＧＤ)與細胞表面的整合素αｖβ3和αｖβ5結合并相互作用使病毒進入細胞。,病毒的受體與入侵細胞的過程,第一代腺病毒載體中,Ｅ1、Ｅ3基因表達盒已經去除了,這樣可以插入長約8kb的外源DNA。去除Ｅ1區(qū)還有一個優(yōu)勢,就是阻止了依賴Ｅ1區(qū)和Ｅ2區(qū)功能蛋白的轉錄和隨后病毒DNA的復制及病毒

8、外殼蛋白的產生。Ｅ1區(qū)缺失的腺病毒可以在能夠反式提供Ｅ1區(qū)基因蛋白的293細胞中得到增殖。,第一代腺病毒載體,,腺病毒基因組結構與載體改造,HEK 293 cells have been engineered to include Adenovirus E1a/E1b genesE1a/E1b genes (integrated into 293 genome) allow replication and transcriptio

9、n of Adenovirus,構建重組腺病毒,構建重組腺病毒的傳統(tǒng)方法是以同源重組為基礎的。其一用修飾的腺病毒DNA與穿梭載體在HEK 293細胞中進行同源重組；通過Cre-loxP系統(tǒng)構建重組腺病毒載體，在轉移質粒和包裝質粒中都插入loxP位點，然后將兩個質粒共轉染表達Cre重組酶的哺乳動物細胞，通過Cre介導兩個loxP位點之間的DNA發(fā)生重組，可獲得重組腺病毒，這種重組效率比一般的細胞內同源效率高30倍。 更為流行的方法采

10、用了穿梭載體與腺病毒質粒轉化一種特殊的菌株(BJ 5183)。然后從細菌中收集重組腺病毒，用其感染HEK 293細胞。,Adeno-X? Expression System,,Adeno-X? Expression System,構建重組腺病毒不同方法比較,Ad5腺病毒可感染的寄主,人體各類組織的細胞，除造血細胞外多種哺乳動物細胞：,Plate 293 cells@ 5x105/well,,Infect cells w/ vi

11、rus dilutions,Hexon proteinsexpressed,,Fix,,Add primaryanti-hexon Ab,,Add HRP conj.secondary,,Develop,Count,Adeno-XTM Rapid Titration Kit,簡單的免疫染色方法整個過程只需48小時. 而傳統(tǒng)繁瑣的方法需要2個星期才能完成對所有重組的Ad5病毒能實現(xiàn)準確而快速的滴度測定,Adeno-XTM Ra

12、pid Titration Kit 的特點,Adeno-XTM Rapid Adenoviral purification System,第二代腺病毒載體是病毒基因組的E2A區(qū)缺失,并突變或缺失E4區(qū)基因。這種載體裝載容量有所增加(可達11kb) ,細胞毒性和免疫原性有所減弱,而目的基因的表達時間更長。,第二代腺病毒載體,一種研究方向：改造腺病毒囊膜表面五鄰體纖維蛋白的結構。根據Adv5纖突蛋白結節(jié)區(qū)的結構特征,去除病毒與受體(CAR

13、,柯薩奇2腺病毒受體)的親和性,經特異性細胞結合分子模擬腺病毒纖突衣殼蛋白,使載體選擇性靶向相應細胞,減少載體的非特異性感染及免疫反應。,提高腺病毒載體的靶向特異性,另一種改造策略：改造腺病毒的基因結構,置換上針對癌細胞的特異型啟動子。如裝上AFP啟動子,使載體特異性感染肝癌細胞。,提高腺病毒載體的靶向特異性,宿主的免疫反應仍然是獲得轉基因長期表達和重復使用腺病毒載體的主要障礙。大量研究已證實,具有感染性的腺病毒載體本身就足以引起免疫

14、反應。 更為“復雜”的腺病毒載體就是第三代腺病毒載體,在其構建時去除了某些病毒基因,甚至是去除了全部的病毒基因。所謂的“空殼”載體起先只保留了ＩＴＲ和包裝信號,且在產生中需要輔助病毒和合適的互補包裝細胞,更需要進一步的純化。,第三代腺病毒載體,第三代新型重組腺病毒載體刪除病毒基因中所有開放閱讀框,僅含有必要的順式元件(即ITR和鄰近的包裝信號序列) ,需要在輔助病毒存在情況下,在包裝細胞中繁殖,其安全性很高。第三代腺病毒載體不但

15、可容納較大的外源基因(32kb) ,而且較容易獲得高滴度( 109pfu /ml) 。,第三代新型重組腺病毒載體,,腺病毒在寄主細胞中呈游離態(tài)，基因瞬時表達可侵染處于分裂期或非分裂期的寄主細胞高水平的蛋白質表達雙載體系統(tǒng)的操作病毒的效價可達 1012 pfu/ml平均可插入8kb的外源片段,長期、穩(wěn)定的基因表達，可以遺傳只能侵染分裂期的寄主細胞中度的蛋白表達水平單一載體操作病毒效價達 106 pfu/ml平均可插

16、入6.5kb的外源片段,腺病毒表達系統(tǒng),逆轉錄病毒表達系統(tǒng),Adeno-X? VS Retrovirus Expression System,,Retroviral Expression System逆轉錄病毒表達系統(tǒng),,Env、pol、gag為RNA病毒中控制復制和表達外膜蛋白的基因。重新構建的反轉錄病毒載體將去除gag、pol、env基因，并將它們整合到包裝細胞株的基因組中。?+是RNA病毒包裝時的識別序列，保留在反轉錄病毒

17、載體中。,逆轉錄病毒載體的構建和改造,逆轉錄病毒的包裝過程,,,Retro-X Retroviral Expression Vectors,LRCX Retroviral Expression Vectors,,,,MSCV Retroviral Expression System,小鼠干細胞病毒表達載體,造血細胞胚胎干細胞胚胎性癌細胞,Pantropic Retroviral Expression System,宿主范圍廣,,

18、泛嗜性逆轉錄病毒表達系統(tǒng),為什么泛嗜性逆轉錄病毒的宿主范圍如此廣？,外膜蛋白識別宿主細胞表面的受體VSV-G外膜蛋白不需識別宿主細胞表面的受體Package cell line GP2-293整合有gag-pol 基因pVSV-G 載體與pLXRN 載體共轉化,Pantropic Retroviral Expression Vector泛嗜性逆轉錄病毒載體,帶GFP報告基因的逆轉錄病毒載體,RevTet-On & Of

19、f? Gene Expression System,,,,tetR： Tc抑制因子VP16：轉錄激活亞基tTA： Tc應答轉錄激活因子 ：四環(huán)素或Dox,tTA,tTA,,RevTet-Off? Gene Expression System,pTet Off,pTRE2,,,RevTet-On? Gene Expression System,,,,,rtetR： 反Tc抑制因子VP16：轉錄激活亞基rtTA：

20、反Tc調控的轉錄因子 ： Dox,,rtTA,rtTA,pTRE2,pTet On,RevTet-Off & On? Gene Expression System,在各種細胞系中建立可調控的基因表達系統(tǒng)Tc 或 Dox 誘導所需的劑量遠小于細胞毒素的水平，不會影響細胞的生長。外源基因表達為激活方式，容易控制。表達水平相比其他組成型的真核強啟動子要高幾十倍?；虮磉_受到嚴謹的調控，可以表達毒性基因等,謝