腺病毒質(zhì)量檢定方法

1、1一、無菌檢查............................................................................................................................2（一）薄膜過濾法................................................................................

2、............................3（二）直接接種法............................................................................................................3二、支原體檢查...................................................................

3、.....................................................4第一法 細(xì)胞培養(yǎng)法..........................................................................................................4第二法 指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA 染色法）..............................

4、......................................5三、細(xì)胞內(nèi)、外源病毒因子檢查............................................................................................71 細(xì)胞形態(tài)觀察及紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)（簡稱血吸附試驗(yàn)）............................................72 不同

5、細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢測(cè)病毒因子............................................................................73 接種動(dòng)物和雞胚法檢測(cè)病毒因子................................................................................84 逆轉(zhuǎn)錄病毒及其他內(nèi)源性病毒或病毒核酸的檢測(cè)..........

6、..........................................81）逆轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)定......................................................................................................82）透射電鏡檢查........................................................

7、....................................................113）感染性試驗(yàn)................................................................................................................115 特殊外源病毒因子的檢測(cè)................................

8、..........................................................11四、致瘤性檢查......................................................................................................................11五、感染效率和病毒的產(chǎn)量等的測(cè)定.................

9、.................................................................12六、細(xì)胞鑒別（染色體檢查）..............................................................................................12七、病毒敏感性檢查...................................

10、...........................................................................13八、細(xì)胞功能檢查..................................................................................................................13九、重組腺病毒滴度的測(cè)定.......

11、...........................................................................................14十、病毒比滴度（比活性 IU）測(cè)定 ....................................................................................16十一、E1A 區(qū)、E2B 區(qū)、AAV 及插入基

12、因的檢測(cè) ...........................................................16一）E1A 區(qū)的檢測(cè) .........................................................................................................16二）E2B 區(qū)的檢測(cè) .........................

13、................................................................................17三）AAV 的檢測(cè)............................................................................................................18四）插入基因的檢測(cè)..........

14、............................................................................................18十二、病毒外源因子檢查......................................................................................................19十三、內(nèi)毒素測(cè)定...

15、...............................................................................................................19供試品溶液的制備...................................................................................................

16、.......19確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD） ................................................................................20方法 1 凝膠法........................................................................................................

17、.......20鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)..................................................................................................21干擾試驗(yàn).................................................................................................

18、.........................21檢查法..............................................................................................................................23十四 效力試驗(yàn)插入基因表達(dá)活性測(cè)定，插入基因的生物學(xué)活性測(cè)定............................24十五

19、 復(fù)制型病毒（RCA）檢測(cè) A549 細(xì)胞檢測(cè)法 ...........................................................24十六 腺相關(guān)病毒的檢測(cè)采用 PCR 法..................................................................................26十七 殘留量測(cè)定應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)工藝及成品的添加成份，對(duì)有潛在危險(xiǎn)性

20、的成份進(jìn)行殘留量檢測(cè)：..................................................................................................................................271 殘余宿主 DNA 含量測(cè)定..............................................................

21、..............................272 殘余牛血清白蛋白含量測(cè)定.......................................................................................273 殘余核酸酶含量測(cè)定..........................................................................

22、.........................28十八 重組病毒制品的穩(wěn)定性試驗(yàn)........................................................................................2836、封閉式薄膜過濾器，濾膜孔徑應(yīng)不大于 0.45um，直徑約為 50mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。② 試驗(yàn)步驟 試驗(yàn)步驟（一）薄膜過濾法 （一）薄膜過濾法：1、

23、將少量的沖洗液過濾，以潤濕濾膜。2、取規(guī)定量，每支（瓶）供試品裝量為 5ml 或以下者，全部轉(zhuǎn)移至含適宜稀釋液 100ml 的無菌容器內(nèi)，混勻，立即過濾；每支（瓶）供試品裝量為 5ml 以上者直接過濾。或全部轉(zhuǎn)移至含適宜稀釋液的無菌容器內(nèi)，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)一般不少于3 次，沖洗量 100ml、總沖洗量不超過 1000ml。沖洗后，2 個(gè)濾器中加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基各 100m

24、l，另一濾器中加入改良馬丁培養(yǎng)基 100ml。3、細(xì)菌置 30-35℃、真菌置 20-25℃培養(yǎng) 14 天，培養(yǎng)期間逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng) 14 天后，不能從外觀上判斷有無菌生長，可取該培養(yǎng)基適量轉(zhuǎn)接種同種新鮮培養(yǎng)基中及營養(yǎng)瓊脂斜面和改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌培養(yǎng) 2 天，真菌培養(yǎng) 3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基中及營養(yǎng)瓊脂和改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上是否有菌生長；或取培養(yǎng)液（

25、物）涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌，必要時(shí)做菌種鑒定。（二）直接接種法 （二）直接接種法：1、取規(guī)定量供試品，等量分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基中（2 種培養(yǎng)基的接種支數(shù)或瓶數(shù)之比為 2:1） 。除有規(guī)定外，每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積，不得大于培養(yǎng)基體積的 10%，同時(shí)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于 15ml，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。2、將上述接種后的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基平均分成兩份，