大鼠移植心臟的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、研究背景:隨著免疫抑制劑的應(yīng)用，心臟保存以及心臟外科技術(shù)的進(jìn)步和高效抗感染藥物的應(yīng)用，心臟移植已成為治療各種終末期心臟疾病的最有效的手段。心臟移植后患者的生存時(shí)間也在不斷延長，但長期研究表明：移植心臟血管病變(CAV)是影響患者長期存活的最主要的原因。根據(jù)流行病學(xué)的研究，采用環(huán)孢霉素A聯(lián)合治療的心臟移植患者，在術(shù)后1、3、5年行血管造影發(fā)現(xiàn)CAV的發(fā)病率分別為14％、37％、50％。采用血管內(nèi)超聲(IVuS)檢查發(fā)現(xiàn)心臟移植1年后，血管

2、內(nèi)膜增厚的發(fā)生率達(dá)50％。而心臟移植患者發(fā)生CAV后1年的生存率為55％, 2年的生存率為25％。CAV確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為是以免疫因素為主的多因素參與的血管增殖型病變，病理變化表現(xiàn)為局部持續(xù)的炎癥反應(yīng)，平滑肌細(xì)胞遷移、增殖，形成彌漫性同心圓狀血管狹窄，晚期脂質(zhì)沉積、鈣化形成粥樣斑塊。對(duì)CAV的診斷目前無可靠的手段，治療無有效的措施，免疫抑制劑的使用不能控制CAV的進(jìn)展，保守治療及PTCA、CABG的效果都差，采用西羅莫司洗

3、脫支架對(duì)狹窄冠脈進(jìn)行介入治療(PCI)，1年內(nèi)再狹窄率為33％，再次心臟移植的生存率明顯低于初次移植，且由于供心來源有限，多數(shù)學(xué)者不主張?jiān)俅涡呐K移植。因此，徹底弄清cAv和心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制，在此基礎(chǔ)上尋找CAV和心肌纖維化的檢測(cè)手段和治療方案是心臟移植研究領(lǐng)域的首要問題。若能直接從蛋白質(zhì)組入手來研究移植后心臟的蛋白質(zhì)變化，將可更全面、真實(shí)地揭示CAV和心肌纖維化的本質(zhì)，為CAV和心肌纖維化的發(fā)病學(xué)和防治研究開辟新的思路、提供新的線索

4、。 本研究采用改良的異體大鼠心臟腹部移植的Ono模型，在移植后早期(手術(shù)后2周)和晚期(手術(shù)后8周)獲取移植心臟標(biāo)本，利用雙向凝膠電泳技術(shù)，構(gòu)建出蛋白質(zhì)凝膠圖像，通過ImagineMaster圖像分析系統(tǒng)，確定差異標(biāo)準(zhǔn)，識(shí)別差異點(diǎn)。獲取差異點(diǎn)后，提取凝膠內(nèi)的蛋白質(zhì)，并鑒定相關(guān)差異蛋白質(zhì)的表達(dá)。 (一)大鼠異位心臟移植模型的建立及改進(jìn) 目的:改良Ono棋型，建立簡(jiǎn)單、可靠的大鼠腹腔異位心臟移植模型；

5、方法:以Wister大鼠為供體，SD大鼠為受體，改良建立大鼠腹腔異位心臟移植模型，分為3組：正常Wister大鼠作為對(duì)照組；移植后亞急性排斥反應(yīng)組C術(shù)后2周)；移植后慢性排斥反應(yīng)組(術(shù)后8周)。分組喂養(yǎng)后按規(guī)定時(shí)間收獲心臟標(biāo)本進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。 結(jié)果:手術(shù)成功率為87.5％。其中麻醉過深死亡2例，疑青霉素過敏死亡1例，術(shù)中出血過多死亡4例。供心移植吻合時(shí)間24.3±7.6min，供心冷缺血時(shí)間34.5±8.2min，腹部觸診

6、移植心臟搏動(dòng)時(shí)間16.8±7.4天。組織形態(tài)學(xué)觀察示：移植心臟心肌組織內(nèi)有大量粒細(xì)胞浸潤；隨著移植后時(shí)間延長，CAV逐漸加重，冠脈數(shù)量減少，心肌萎縮并心肌纖維化發(fā)生。 結(jié)論:改良Ono模型建立的心臟移植模型具有簡(jiǎn)單、可靠的優(yōu)點(diǎn)。收獲的移植心臟標(biāo)本在組織形態(tài)學(xué)上反映了CAV和心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展的過程，為進(jìn)斗步利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究移植心臟CAV和心肌纖維化的發(fā)生機(jī)理提供理想的組織標(biāo)本。 (二)大鼠移植心臟的蛋白質(zhì)組學(xué)

7、研究 目的：在第一步的基礎(chǔ)上，進(jìn)行移植后心肌組織的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，尋找移植后心肌表達(dá)的特異蛋白質(zhì)變化，為CAV和心肌纖維化的發(fā)病學(xué)和防治研究開辟新的思路、提供新的線索。 方法：對(duì)移植后不同時(shí)間的兩組大鼠心肌組織和配對(duì)的正常心臟組織進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，即利用固相pH梯度(IPG)雙向凝膠電泳(2-DE)分離大鼠移植后心肌組織和正常心肌組織的總蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)染色后經(jīng)圖像分析識(shí)別差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解

8、吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(DI-TOF-Ms)鑒定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。 結(jié)果：(1)得到了分辨率較高、重復(fù)性較好的大鼠移植后心肌組織和正常心肌組織的雙向凝膠電泳圖譜(24cm IPG膠條pH 3-10)，移植后兩組心肌組織和正常配對(duì)組織各平均膠的平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為512±41、524±53和524±53；同組心肌組織的4塊不同的膠之間蛋白質(zhì)點(diǎn)在等電聚焦(IEF)方向的偏差是O.31±0.175mm，在十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電

9、泳(SDS-PAGE)方向上的偏差為O.675±O.237mm；(2)比較分析16例兩組移植后心臟組織與正常配對(duì)的心臟組織的雙向凝膠電泳圖譜，平均匹配的點(diǎn)數(shù)為518±68，找到差異蛋白質(zhì)點(diǎn)65個(gè)；(3)對(duì)37個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行了肽質(zhì)指紋圖分析，鑒定出一些與心肌代謝、應(yīng)激與抗應(yīng)激反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)與增殖有關(guān)的蛋白質(zhì)。 結(jié)論：(1)心臟移植后心肌組織發(fā)生代謝轉(zhuǎn)變，即向無氧、“胚胎”形式轉(zhuǎn)化；(2)心臟移植后心臟組織中應(yīng)激反應(yīng)與抗應(yīng)激反