基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)新方法研究磷酸化和糖基化修飾蛋白質(zhì).pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩147頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)

文檔簡介

1、本論文針對后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究中磷酸化蛋白質(zhì)和糖基化蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析所面臨的特異性富集和檢測靈敏度等熱點難點問題,將多種技術(shù)手段,包括納米技術(shù)、化學(xué)衍生、信號放大等,與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分析方法相結(jié)合,開展了一系列的研究工作,發(fā)展了與之相關(guān)的質(zhì)譜鑒定新技術(shù)和新方法,并取得了實際應(yīng)用方面的成功,獲得了一些創(chuàng)新性的研究成果。文章主要內(nèi)容和所取得的主要研究成果摘要如下:
  第一章概述了質(zhì)譜鑒定前處理技術(shù)對于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的意義所在和其中存在的

2、主要問題,對于近年來所發(fā)展的各種低豐度蛋白質(zhì)預(yù)富集新技術(shù)新方法分門別類的進行了細致的歸納總結(jié)。分析了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中所面臨的主要困難,并按照各種富集方法所采用的原理進行了分類并一一作了詳細的闡述。此外,針對納米技術(shù)在蛋白質(zhì)富集中的應(yīng)用展開了綜述,對于不同種類的納米材料富集低豐度肽段/蛋白質(zhì)的方法分類進行了總結(jié),并歸納了后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)中納米材料富集方法的特點且作了詳盡的闡述。最后,提出了本論文選題的目的和意義所在

3、。
  第二章針對翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究中磷酸化肽段的質(zhì)譜鑒定問題,發(fā)展了基于羧基衍生反應(yīng)增強磷酸化多肽電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)質(zhì)譜分析的新策略。由于ETD質(zhì)譜在使肽段裂解的同時能夠保留肽鏈上的后修飾信息,對于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)來說,采用ETD質(zhì)譜分析磷酸化肽段具有巨大的潛力。然而,ETD質(zhì)譜只適用于帶兩個或兩個以上電荷的肽段,而在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中通常采用胰蛋白酶酶解的磷酸化肽段在電噴霧質(zhì)譜中較一般的胰酶酶解肽段更難帶上多電荷,這就

4、限制了ETD質(zhì)譜技術(shù)對于磷酸化位點的分析。采用本研究中的策略,肽段上所有的羧基基團,包括C端和肽鏈上酸性氨基酸殘基上的羧基,與衍生試劑1-(2-嘧啶基)哌嗪(PP)反應(yīng)從而帶上化學(xué)標簽。衍生標記后的磷酸化肽段的電荷態(tài)大幅度增加,此時再使用ETD質(zhì)譜對其進行分析就顯示出衍生標記的優(yōu)勢所在:在電噴霧離子源中電離時主要以單電荷分子離子形式存在的肽段原本并不能夠使用ETD質(zhì)譜進行分析,然而經(jīng)過羧基衍生處理后,其電荷態(tài)有所增加,這時就能采用ETD

5、裂解技術(shù)就能得到該肽段豐富的串聯(lián)質(zhì)譜圖信息。此外,PP衍生技術(shù)還能提高二氧化鈦富集法的特異性。這是因為衍生反應(yīng)封閉了肽段上的羧基基團,從而消除了羧基與二氧化鈦之間的相互作用,因此減少了富集過程中的非特異性吸附,提高了富集效率。衍生后的磷酸化肽段在反相液相色譜柱中的保留時間也有所增加,克服了某些磷酸化肽段在傳統(tǒng)的反相液相色譜中難以分離的困難。
  第三章針對翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究中糖基化肽段/蛋白質(zhì)的分離富集問題,合成了具有核-衛(wèi)

6、星結(jié)構(gòu)的功能納米復(fù)合材料,并以此新型材料為基礎(chǔ)發(fā)展了新的糖基化肽段/蛋白質(zhì)富集方法,將其成功地應(yīng)用于人類大腸癌第三期臨床組織樣本的N-糖基化位點的分析鑒定中。糖基化蛋白質(zhì)的天然含量非常低,再加上由于糖鏈結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使得每個可能發(fā)生糖基化修飾的位點上又存在微相上的不均一性,因此對于糖基化肽段/蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜分析前處理非常必要。到目前為止,所發(fā)展的各類富集方法都有其固有的缺點。由于糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需要,急需發(fā)展更為簡單靈敏且適用性廣的富集

7、新方法。近年來,納米技術(shù)的飛速發(fā)展使其被廣泛的應(yīng)用于各種生物樣品的分離分析研究中,而其中納米復(fù)合材料因為集合了各種材料本身獨有的特性,能夠發(fā)揮出更大的優(yōu)勢,使得研究者們對于復(fù)合材料的關(guān)注度日益增加。本研究中合成的新型納米復(fù)合材料由二氧化硅包裹的鐵磁核心和修飾在磁核上的大量納米金顆粒組成。其中,高質(zhì)量的磁性納米材料通過水熱反應(yīng)得到,其粒徑分布十分均勻。隨后,我們采用溶膠-凝膠法將正硅酸乙酯水解濃縮產(chǎn)生的二氧化硅沉積到Fe3O4磁珠表面,形

8、成由薄層二氧化硅包裹的磁性納米顆粒。本章研究中所用到的納米金是采用檸檬酸鈉還原法制備得到的。每個納米金顆粒表面通過自組裝修飾上大量的有機長鏈,在其鏈末端共價鍵合上能跟糖鏈特異性結(jié)合的硼酸官能團。這些有機長鏈的存在既可以降低被材料捕獲的目標分子之間的空間位阻效應(yīng),又可以抑制材料表面的非特異性吸附。因此,在此基礎(chǔ)上發(fā)展的糖基化蛋白質(zhì)分離富集方法簡單有效,具有很好的特異性,適用于濃度極低的糖基化肽段/蛋白質(zhì)。該方法的富集特異性不論是在對標準糖

9、基化蛋白質(zhì)的選擇性富集還是在胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的富集中都得到了證實。實驗結(jié)果表明,每克材料的吸附容量達到約79mg辣根過氧化物酶蛋白,遠高于同類型的商品化磁珠。對于所富集到的肽段/蛋白質(zhì),只需使用磁鐵就能將其從溶液體系中分離,根據(jù)樣品復(fù)雜程度進行清洗后,加入酸性的洗脫液即可將目標肽尉蛋白質(zhì)從材料上洗脫下來。采用我們發(fā)展的這種富集技術(shù),所得到的糖基化肽段和糖基化蛋白質(zhì)的回收率分別能達到85.9%和71.6%。當將此富集方法應(yīng)用于分析人類大腸

10、癌組織樣品的N-糖基化位點時,共鑒定到155個非冗余糖基化蛋白質(zhì)上的194個N-糖基化位點,其中165個位點都是以前文獻沒有報道過的,占85.1%。
  第四章針對翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究中糖基化蛋白質(zhì)的質(zhì)譜檢測問題,發(fā)展了一種采用硼酸修飾磁珠分離糖基化蛋白質(zhì)后對之進行納米金標記,從而將糖基化蛋白質(zhì)的質(zhì)譜信號轉(zhuǎn)化成納米金的質(zhì)譜信號的高靈敏度的質(zhì)譜檢測方法。使用MALDI質(zhì)譜直接檢測納米金時可以得到強度很高的Au2+的峰,其背景噪音

11、幾乎可以忽略,因此選擇納米金粒子作為質(zhì)譜信號報告分子非常理想。由于每個納米金粒子包含超過64000個金原子,因此采用納米金檢測時的Au2+信號替代糖基化蛋白質(zhì)的質(zhì)譜信號的方法從理論上來講能夠?qū)⑿盘枏姸确糯蠛脦讉€數(shù)量級。在本章研究中,我們使用硼酸修飾的磁珠將糖基化蛋白質(zhì)從溶液中分離后,通過將納米金粒子表面修飾的羧基與蛋白質(zhì)上游離氨基的反應(yīng)將其共價鍵合于蛋白質(zhì)肽鏈上。然后,再用酸性洗脫液將標記有納米金的糖基化蛋白質(zhì)從磁珠上釋放,重新進入溶液

12、體系,最后進行MALDI質(zhì)譜分析,檢測Au2+的信號。實驗結(jié)果表明,采用這種信號放大的策略,對于辣根過氧化物酶的檢測限可以降至7.695fM(S/N=3),而對另外兩種標準糖基化蛋白質(zhì)--去唾液酸胎球蛋白和核糖核酸酶B的檢測限也能降至18.87fM(S/N=3)和322.2fM(S/N=3)。
  第五章針對糖基化翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的肼化學(xué)分離富集方法存在的問題,合成了氨基修飾的磁性納米顆粒,并以此材料為基礎(chǔ)發(fā)展了富集糖基

13、化多肽的方法,同時對于富集流程進行了初步的優(yōu)化。肼化學(xué)富集法的適用范圍非常廣,無論是N-糖基化蛋白質(zhì)還是O-糖基化蛋白質(zhì),其糖鏈經(jīng)氧化后都可以通過肼腙反應(yīng)對之進行富集。然而,酰肼基具有強還原性,且極易水解生成肼,由于肼的毒性較大,因此在操作時需要特別小心。本章研究中則以更穩(wěn)定更溫和的氨基修飾磁性納米顆粒為基礎(chǔ)發(fā)展了同樣適用范圍較廣的糖基化多肽富集法:首先使用強氧化劑高碘酸鈉,將糖鏈上的羥基氧化成醛基,通過活潑的醛基與氨基之間的反應(yīng)將糖基

14、化多肽固體到磁珠上,選擇合適的清洗緩沖溶液反復(fù)清洗材料,除去表面非特異性吸附的肽段,最后使用肽N-糖苷酶F(PNGaseF)對磁珠上的糖基化多肽進行去糖基化處理后將其從材料上釋放,最終進行質(zhì)譜分析。我們對于富集流程中的清洗步驟進行了詳細的優(yōu)化考察,確定了最優(yōu)清洗條件,實現(xiàn)了對于標準糖基化蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中糖基化多肽的特異性富集。
  總之,本論文圍繞翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究中磷酸化蛋白質(zhì)和糖基化蛋白質(zhì)特異性富集和質(zhì)譜鑒定方面的熱點難

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論