體外抗菌實驗

1、,第二十章 藥物的體外抗菌試驗,藥物的體外抗菌試驗 藥物的體外抗菌試驗是在體外測定微生物對藥物敏感程度的試驗， 已廣泛地應(yīng)用于科研、生產(chǎn)和臨床。如抗菌藥物的篩選、提取過程中的追蹤、抗菌譜的定、藥物含量的測定、藥物血濃度測定、指導(dǎo)臨床用藥的藥敏試驗等?？咕囼灠ㄒ质a試驗和殺菌試驗。抑菌：即抑制微生物的生長繁殖，但不能殺死微 生物，在藥物除去后微生物又能生長.殺菌：即

2、能殺死微 生物，當(dāng)藥物除去后，微生 物也不能再生長繁殖。,,第一節(jié) 常用的體外抑菌試驗,連續(xù)稀釋法： 可用于測定藥物的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)?？梢杂靡后w培養(yǎng)基，也可用固體培養(yǎng)基。,1．液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法 2．固體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法 分平板法和斜面 法。,,瓊脂擴散法： 是利用藥物可以在瓊脂培養(yǎng)基中擴散，在藥物有效濃度的范圍內(nèi)形成抑菌圈或抑菌距離，

3、以抑菌圈直徑或抑菌距離的大小來評價藥物抗菌作用強弱。,1、濾紙片法 適用于新藥的初篩試驗。2．打孔法 適于藥物血濃度的監(jiān)測。3．挖溝法 適用于在一個平板上試驗一種藥物對幾種試驗菌的抗菌作用。,,第二節(jié) 殺菌試驗用以評價藥物對微生物的致死活性。最低殺菌濃度： 指該藥物能殺死細菌的最低濃度。從對微生物廣義而言，也可稱之為最低致死濃度(MLC)。,是將待檢藥物先以合適

4、的液體培養(yǎng)基在試管內(nèi)進行連續(xù)稀釋，每管內(nèi)再加入一定量的試驗菌液，培養(yǎng)后可得該藥物的MIC，取MIC終點以上未長菌的各管培養(yǎng)液，分別移種于另一無菌平板上，培養(yǎng)后凡平板上無菌生長的藥物最低濃度即為該藥物的MBC(或MLC)。,,,活菌計數(shù)法 是在一定濃度的定量藥物內(nèi)加入定量的試驗菌，作用一定時間后，取樣進行活菌計數(shù)，從存活的微生物數(shù)計算出藥物對微生物的致死率。石炭酸系數(shù)（又稱酚系數(shù)） 是以石炭酸為標(biāo)準(zhǔn)，在規(guī)

5、定的試驗條件下，作用一定時間，將待測的化學(xué)消毒劑與石炭酸對傷寒沙門菌或金黃色葡萄球菌的殺菌效力相比較， 所得殺菌效力的比值。,,棋盤格法 是由于在試驗時，含兩種不同濃度藥物的試管排列呈棋盤狀而得名， 用以評價兩種藥物同時用不同濃度進行聯(lián)合試驗時的抗菌活性。,,第三節(jié) 聯(lián)合抗菌試驗,在藥學(xué)上作中，常需檢查兩種抗菌藥物在聯(lián)合應(yīng)用時的相互作用以及抗菌藥物與不同pH值或不同離子溶液的相互影響。如加強藥物抗菌作用的為協(xié)

6、同(synergism)；減弱藥物作用的為拮抗(antagonism)；相互無影響的為無關(guān)(indjfference)；作用為二者之和的為累加(addition)。,,紙條試驗 即在已接種試驗菌的平板表面垂直放置兩條各浸有一種藥液的濾紙條，培養(yǎng)后根據(jù)抑菌區(qū)的加強、減弱或無影響來判斷它們在聯(lián)合應(yīng)用時的效應(yīng)。,梯度平板紙條試驗 需先制備含藥的梯度平板。將試驗菌懸液涂布于平板表面，取濾紙條浸透另一待檢藥液，按梯

7、度平板中藥物濃度遞減的方向置于平板表面。培養(yǎng)后，如該待檢藥液對平板內(nèi)的藥物有加強作用，則可見沿紙條兩邊的抑菌區(qū)被擴大。,,第四節(jié) 體外抗菌試驗的影響因素,1．試驗菌 在抗菌試驗中所用試驗菌一般應(yīng)該用標(biāo)準(zhǔn)菌株。2．培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的質(zhì)量須加控制。3．抗菌藥物 藥物的濃度和總量直接影響抗菌試驗的結(jié)果，需要精確配制。,,第二十一章藥物制劑的微生物學(xué)檢查,,藥物制劑的微生物學(xué)檢查,藥物制劑的微生物

8、學(xué)檢查主要包括無菌檢驗，細菌總數(shù)測定，霉菌總數(shù)測定，以及病原菌的檢驗與螨的檢測等。,,第一節(jié) 無菌制劑的無菌檢查,（一）一般藥品的無菌檢查 一般藥品的無菌檢查法屬于直接接種法，即將檢品按規(guī)定量直接分別接種于適宜需氧菌、厭氧菌和真菌生長繁殖的一定量的培養(yǎng)基中，同時以同樣的培養(yǎng)基作陽性對照試驗。,我國藥典規(guī)定以金黃色葡萄球菌CMCC(B) 26003、生袍梭狀芽胞桿菌CMCC(B)64941、白假絲

9、酵母菌CMCC(F)98001作為需氧菌、厭氧菌和真菌的陽性對照菌株。,,（二）特殊藥品的無菌檢查法 如果陽性對照管不長菌，則必須進行特殊處理后方可按照一般藥品的無菌檢查法進行。,1．油類藥物的無菌檢查 一般油劑因與常規(guī)培養(yǎng)基不混溶，藥品中的微生物不易生長，所以一般可采用吐溫培養(yǎng)基，其余同一般藥品無菌檢查法。,,2．抗菌藥物或含防腐劑藥物的無菌檢查 如果被檢藥品具

10、有抗菌作用，陽性對照管及試驗管均可能不長菌。因此在進行無菌檢查前必須采用一些方法除去藥物本身的抗菌作用，然后再依上述方法進行無菌檢查。,(1)加入滅活劑(2)微孔濾膜法(3)稀釋法(4)離心沉淀法,,第二節(jié) 口服藥及外用藥物的微生物學(xué)檢查,目前對口服藥及外用藥物的微生物學(xué)檢驗主要是微生物限量檢驗，即限制口服藥及外用藥的微生物總數(shù)和限制病原微生物種類的系列測定項目。,,我國規(guī)定的項目有： 細菌總數(shù)測定，霉菌總數(shù)測定。

11、病原菌(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌和破傷風(fēng)梭菌)的檢驗和活螨的檢驗等。判斷合格與否的標(biāo)準(zhǔn)是： 口服藥及外用藥中微生物總量須低于規(guī)定限量外，并須在口服藥物每克或每毫升中不得含有大腸埃希菌、沙門菌；外用藥物每克或每毫升中不得含有銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和破傷風(fēng)梭菌，此外均不得檢出活螨。,,,細菌總數(shù)的測定: 是了解被檢藥品在單位重量或體積(每克或每毫升)內(nèi)所含有的活菌數(shù)(實際是

12、需氧菌的活菌數(shù))，以判斷供試藥物被細菌污染的程度，是對該藥品整個生產(chǎn)過程的衛(wèi)生學(xué)總評價的一個重要依據(jù)。,,,霉菌和酵母菌總數(shù)的測定： 是考察供試藥物中每克或每毫升所含的活霉菌和酵母菌的總數(shù)，以判明檢品被真菌污染的程度。,,,病原菌檢驗的原則： 病原菌的形態(tài)和培養(yǎng)特征的觀察是鑒別的基本要求，對生化反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng)、動物毒力試驗等項目的要求因菌而異，各有其側(cè)重點。,一般的檢測程序為：藥物的準(zhǔn)備或預(yù)處理→

13、增菌培養(yǎng)→分離培養(yǎng)→純培養(yǎng)→染色鏡檢、生化試驗、血清學(xué)試驗、動物試驗等→結(jié)果判斷。,,,凡由檢品中檢出大腸埃希菌時，表明該藥品可能被糞便污染，患者服用后，有被糞便中可能存在的其他腸道致病菌和寄生蟲卵等病原體感染的危險。因此，口服藥品中不得檢出大腸埃希菌。檢驗要點：(1)形態(tài)：革蘭陰性短小無芽胞桿菌。(2)分離培養(yǎng)：在伊紅美蘭（EMB)培養(yǎng)基上分解乳 糖，產(chǎn)生紫黑色、有金屬光澤的菌落。 (3)生化反應(yīng)：乳糖發(fā)酵試驗：產(chǎn)酸產(chǎn)氣

14、或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；IMViC試驗：++--，注意與產(chǎn)氣桿菌相區(qū)別。,1、大腸埃希菌,,,檢驗要點：(1)形態(tài)：革蘭陰性短小桿菌。(2)分離培養(yǎng)：SS瓊脂上，沙門菌不分解乳糖，產(chǎn)生H2S，菌落無色、透明或半透明，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，菌落中心呈黑褐色。EMB平板上菌落呈無色或粉紅色。二糖鐵培養(yǎng)基TSl上分解葡萄糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解乳糖、蔗糖，有動力、產(chǎn)生黑色沉淀。(3)生化反應(yīng)：見表21—l。(4)血清學(xué)反應(yīng)：用可疑菌作為抗原

15、，沙門菌A—F組的多價血清作為抗體進行玻片凝集反應(yīng)，并以生理鹽水做對照試驗。,2、沙門菌,,,3、銅綠假單胞菌檢驗要點：(1)形態(tài)：革蘭陰性短桿菌。(2)分離培養(yǎng)：在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上菌落扁平，無定形，濕潤，周邊擴散或略有蔓延，灰白色，培養(yǎng)基上擴散有水溶性綠色色素。(3)生化反應(yīng)：氧化酶試驗陽性，綠膿菌素試驗陽性，可報告檢出銅綠假單胞菌。如綠膿菌素陰性，必須明膠液化試驗陽性，硝酸鹽還原試驗陽性，42℃生長試驗陽性，才

16、可報告被檢品檢出銅綠假單胞菌。,,,4、金黃色葡萄球菌檢驗要點：(1)形態(tài)：革蘭陽性球菌，葡萄狀排列。(2)分離培養(yǎng)及生化試驗：見表21-3如分離培養(yǎng)的可疑菌甘露醇和血漿凝固酶試驗均為陽性，則可判斷為檢出金黃色葡萄球菌。,,,5、破傷風(fēng)梭菌 檢驗要點：(1)形態(tài)：革蘭陽性芽胞梭菌，菌體細長，帶芽胞的菌體呈鼓楷狀。有周鞭毛，能運動，不形成英膜。(2)分離培養(yǎng)：葡萄糖疤肉培養(yǎng)基中生長，消化肉渣，使肉渣變黑，有特殊臭味。新霉

17、素葡萄糖血平板上菌落蔓延生長，霧狀、細絲狀或羽毛狀，邊緣不整齊，常有β溶血環(huán)。(3)毒力試驗：白鼠皮下注射菌液，6~48小時觀察發(fā)病情況。出現(xiàn)典型的破傷風(fēng)病癥的，判定為陽性。,,,螨：是一種小形的節(jié)肢動物，可污染藥物制劑，使之變質(zhì)失效，并可直接危害人體健康，傳染疾病，引起皮炎、過敏性疾患或消化道、泌尿道和呼吸道疾病。因此，口服藥及外用藥中均不得檢出活螨?；铗臋z查方法一般有： 直檢法、漂浮法和分離法三種，最后都在顯