舒林酸體外抗結(jié)腸腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究非甾體抗炎藥舒林酸體外抗結(jié)腸腫瘤作用，從舒林酸對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo的生長(zhǎng)抑制、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、對(duì)腫瘤細(xì)胞周期分布以及對(duì)結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞基因表達(dá)譜的改變等方面探討其抗結(jié)腸癌的作用機(jī)制． 方法： 1.采用MTT法以培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，5-Fu為陽(yáng)性對(duì)照，觀察舒林酸不同濃度，不同作用時(shí)間對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo體外生長(zhǎng)增殖的影響。 2.倒置相差顯微鏡觀察不同濃度舒林酸作用不同時(shí)間后對(duì)Lovo細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變

2、。 3.透射電鏡、吖啶橙(AO)熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)觀察不同濃度舒林酸對(duì)Lovo細(xì)胞凋亡的影響。 4.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度舒林酸作用不同時(shí)間后對(duì)Lovo細(xì)胞周期分布的影響。 5.利用基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)舒林酸作用前后人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞基因表達(dá)譜的改變。 結(jié)果： 1.舒林酸對(duì)Lovo細(xì)胞生長(zhǎng)活力具有明顯的抑制作用，此作用與舒林酸呈量效、時(shí)效關(guān)系。舒林酸對(duì)Lovo細(xì)胞作用24h、48h

3、、72h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為1.927 mmol/L、 0.866mmol/L，0.408 mmol/L。 2.舒林酸誘導(dǎo)Lovo細(xì)胞凋亡，倒置相差顯微鏡下，未經(jīng)舒林酸處理的Lovo哦細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞透亮，折光性好。經(jīng)舒林酸處理后的細(xì)胞失去其正常的多角型或梭型形態(tài)，變少、變圓變小，細(xì)胞問的緊密連接消失并部分脫落漂浮于培養(yǎng)液中，時(shí)間越長(zhǎng)濃度越大越明顯，漂浮細(xì)胞越多； 透射電鏡觀察到舒林酸(0.9mmol/L)

4、作用48h后Lovo細(xì)胞呈典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征：細(xì)胞變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)高度凝聚，邊緣化濃縮呈細(xì)小團(tuán)塊聚集于核膜處，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞膜完整并可見包膜下陷，有典型的凋亡小體。AO熒光染色以發(fā)現(xiàn)O．9mmol/L的舒林酸處理48h后有大量染色質(zhì)濃染碎裂呈黃綠色熒光的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)。 3.FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，舒林酸處理后的Lovo細(xì)胞凋亡率均明顯高于對(duì)照組，且呈時(shí)間和劑量依賴性。另外，舒林酸可使Lovo細(xì)胞阻滯于G0/G1期，并隨藥物濃度的

5、增大阻滯于該期的細(xì)胞增多。 4.表達(dá)譜芯片研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)舒林酸(0.9mmol/L)作用48h后可引起大量的基因表達(dá)改變，在與含有17101個(gè)cDNA的基因芯片雜交，共篩選出差異表達(dá)基因1013條，其中表達(dá)上調(diào)基因434條(占42.84％)，表達(dá)下調(diào)的基因579條(占51.76％)；其中178條為凋亡相關(guān)基因(表達(dá)上調(diào)的有82條，下調(diào)的有96條)，占所有差異表達(dá)基因的17.87％，未知分子功能的有30條(上調(diào)13條，下調(diào)17條)。差

6、異表達(dá)基因主要為與凋亡、細(xì)胞受體及骨架、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，免疫及腫瘤發(fā)展相關(guān)的基因。表達(dá)明顯上調(diào)的基因有：GDFl5、AREG、 ASNS、KLF2、 EGR1、 IL-11、 SESN2、 CDCl6、 MEPlA、S100P、PROl073、JUNB、 SH3GL1、 TXNRDl、PSME2、TM7SF2；表達(dá)明顯下調(diào)的基因有：CDCA3、CDCA8、KIF20A、BIRC5、C220rfl8、ESPL1、NONO、UBE2C、CCNA2

7、、CENPF、PLAU、KIF11、DLEU2、MYBL2、CEN-PE、HISTlH4F、CNAP1、C10orf3、DLG7、BIRC5、CCNB2GTSE1、ANLN、TCFl9 PPPlRl6A、UHRF1、AURKB、CAV1、PLK1、MGC16044、STK6。 結(jié)論：舒林酸在體外對(duì)人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，其抗腫瘤的機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)凋亡或周期相關(guān)基因的表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，從而誘導(dǎo)