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文檔簡介
1、目的:研究非甾體抗炎藥舒林酸體外抗結腸腫瘤作用,從舒林酸對人結腸癌細胞株Lovo的生長抑制、誘導細胞凋亡、對腫瘤細胞周期分布以及對結腸癌Lovo細胞基因表達譜的改變等方面探討其抗結腸癌的作用機制. 方法: 1.采用MTT法以培養(yǎng)液為陰性對照,5-Fu為陽性對照,觀察舒林酸不同濃度,不同作用時間對人結腸癌細胞株Lovo體外生長增殖的影響。 2.倒置相差顯微鏡觀察不同濃度舒林酸作用不同時間后對Lovo細胞形態(tài)學的改變
2、。 3.透射電鏡、吖啶橙(AO)熒光染色、流式細胞術(FCM)觀察不同濃度舒林酸對Lovo細胞凋亡的影響。 4.利用流式細胞術檢測不同濃度舒林酸作用不同時間后對Lovo細胞周期分布的影響。 5.利用基因表達譜芯片檢測舒林酸作用前后人結腸癌Lovo細胞基因表達譜的改變。 結果: 1.舒林酸對Lovo細胞生長活力具有明顯的抑制作用,此作用與舒林酸呈量效、時效關系。舒林酸對Lovo細胞作用24h、48h
3、、72h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為1.927 mmol/L、 0.866mmol/L,0.408 mmol/L。 2.舒林酸誘導Lovo細胞凋亡,倒置相差顯微鏡下,未經(jīng)舒林酸處理的Lovo哦細胞貼壁生長,細胞透亮,折光性好。經(jīng)舒林酸處理后的細胞失去其正常的多角型或梭型形態(tài),變少、變圓變小,細胞問的緊密連接消失并部分脫落漂浮于培養(yǎng)液中,時間越長濃度越大越明顯,漂浮細胞越多; 透射電鏡觀察到舒林酸(0.9mmol/L)
4、作用48h后Lovo細胞呈典型的凋亡形態(tài)學特征:細胞變小,細胞質(zhì)濃縮,染色質(zhì)高度凝聚,邊緣化濃縮呈細小團塊聚集于核膜處,胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡,細胞膜完整并可見包膜下陷,有典型的凋亡小體。AO熒光染色以發(fā)現(xiàn)O.9mmol/L的舒林酸處理48h后有大量染色質(zhì)濃染碎裂呈黃綠色熒光的凋亡細胞出現(xiàn)。 3.FCM檢測發(fā)現(xiàn),舒林酸處理后的Lovo細胞凋亡率均明顯高于對照組,且呈時間和劑量依賴性。另外,舒林酸可使Lovo細胞阻滯于G0/G1期,并隨藥物濃度的
5、增大阻滯于該期的細胞增多。 4.表達譜芯片研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)舒林酸(0.9mmol/L)作用48h后可引起大量的基因表達改變,在與含有17101個cDNA的基因芯片雜交,共篩選出差異表達基因1013條,其中表達上調(diào)基因434條(占42.84%),表達下調(diào)的基因579條(占51.76%);其中178條為凋亡相關基因(表達上調(diào)的有82條,下調(diào)的有96條),占所有差異表達基因的17.87%,未知分子功能的有30條(上調(diào)13條,下調(diào)17條)。差
6、異表達基因主要為與凋亡、細胞受體及骨架、信號轉導,免疫及腫瘤發(fā)展相關的基因。表達明顯上調(diào)的基因有:GDFl5、AREG、 ASNS、KLF2、 EGR1、 IL-11、 SESN2、 CDCl6、 MEPlA、S100P、PROl073、JUNB、 SH3GL1、 TXNRDl、PSME2、TM7SF2;表達明顯下調(diào)的基因有:CDCA3、CDCA8、KIF20A、BIRC5、C220rfl8、ESPL1、NONO、UBE2C、CCNA2
7、、CENPF、PLAU、KIF11、DLEU2、MYBL2、CEN-PE、HISTlH4F、CNAP1、C10orf3、DLG7、BIRC5、CCNB2GTSE1、ANLN、TCFl9 PPPlRl6A、UHRF1、AURKB、CAV1、PLK1、MGC16044、STK6。 結論:舒林酸在體外對人結腸癌Lovo細胞生長具有明顯的抑制作用,其抗腫瘤的機制可能是通過調(diào)節(jié)凋亡或周期相關基因的表達,阻滯細胞周期于G0/G1期,從而誘導
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