微生物代謝的人工控制

1、微生物代謝的人工調(diào)控,,第一節(jié) 微生物代謝的人工控制簡(jiǎn)介第二節(jié) 發(fā)酵工程流程第三節(jié)微生物代謝的人工調(diào)控方法第四節(jié)微生物的代謝途徑修飾改變代謝途徑擴(kuò)展代謝途徑轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑第五節(jié)微生物代謝途徑修飾的應(yīng)用,第一節(jié) 微生物代謝的人工控制簡(jiǎn)介,微生物代謝的人工控制一個(gè)嶄新的科學(xué)領(lǐng)域,它綜合了分子生物學(xué)、微生物學(xué)、分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、生化工程等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域的最新成果,是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)；代謝工程被視為繼蛋白質(zhì)多肽單基因表

2、達(dá)的第一代基因工程、基因定向突變的第二代基因工程(即蛋白質(zhì)工程)之后的第三代基因工程。,人工控制改造后自身效率提高實(shí)例,微生物代謝酶的活性調(diào)節(jié)以酶分子結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)指調(diào)節(jié)胞內(nèi)已有酶分子的構(gòu)象或分子結(jié)構(gòu)來(lái)改變酶活性，從而調(diào)節(jié)所催化的代謝反應(yīng)的速率的方式。是酶分子水平上的調(diào)節(jié)，屬于精細(xì)的調(diào)節(jié)。特點(diǎn)：作用直接、響應(yīng)快、可逆,Allosteric regulation,微生物代謝的人工控制實(shí)例,人工控制微生物代謝的目的——,當(dāng)賴氨酸和蘇氨酸都

3、積累過(guò)量時(shí)，就會(huì)抑制天冬氨酸激酶的活性，使細(xì)胞內(nèi)難以積累賴氨酸；而賴氨酸單獨(dú)過(guò)量就不會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象。,,最大限度積累對(duì)人類有用的代謝產(chǎn)物,黃色短桿菌,,1、菌種的選育,2、,3、,4、,5、發(fā)酵過(guò)程（中心階段）,,6、產(chǎn)品的分離提純,,第二節(jié) 發(fā)酵工程流程,1、菌種選育的常用方法比較,基因突變,DNA重組,細(xì)胞融合,物理、化學(xué)、生物因素誘變,能大幅度改變某些性狀、操作簡(jiǎn)便，但也具有很大的盲目性。,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中，構(gòu)建工程菌或工

4、程細(xì)胞。,能定向改變微生物的遺傳性狀，但操作過(guò)程復(fù)雜、要求高。,體細(xì)胞雜交等方法,能克服遠(yuǎn)源雜交不親合的障礙，定向改變遺傳性狀。,根據(jù)不同的菌種，應(yīng)選擇不同的原料配制培養(yǎng)基。配制的培養(yǎng)基應(yīng)滿足微生物在碳源、氮源、生長(zhǎng)因子、水、無(wú)機(jī)鹽等方面的營(yíng)養(yǎng)要求，并為微生物提供適宜的PH。培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)，以利于產(chǎn)物的合成。培養(yǎng)基在滿足微生物的營(yíng)養(yǎng)的需求的基礎(chǔ)上，應(yīng)盡量降低生產(chǎn)成本，以得到更高的經(jīng)濟(jì)效益。,2、培養(yǎng)基的配制,原則有三：,3、滅菌

5、,4、擴(kuò)大培養(yǎng)和接種,殺死雜菌防止雜菌與發(fā)酵菌形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，對(duì)發(fā)酵過(guò)程造成不良影響。,擴(kuò)大培養(yǎng)是將培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的菌體分開(kāi)，分頭進(jìn)行培養(yǎng)，以促使菌體數(shù)量快速增加，能在短時(shí)間里得到大量的菌體。接種時(shí)要防止雜菌的污染。,5、發(fā)酵過(guò)程： （中心階段，重點(diǎn)是在發(fā)酵條件的控制）,對(duì)需氧型生物保證氧的供應(yīng)，對(duì)厭氧型生物控制氧的供應(yīng)。 措施：控制通氣量和攪拌速度等。,加酸、加堿或加緩沖

6、液,注意降溫，使溫度控制在所培養(yǎng)微生物的最適溫度。措施：控制攪拌速度、冷卻水的循環(huán)速度等。,,6、分離 提純：,菌體：過(guò)濾、沉淀代謝產(chǎn)物：蒸餾、萃取、離子交換,,第三節(jié) 微生物代謝的人工調(diào)控方法,1 目的 最大限度的積累對(duì)人類有用的代謝產(chǎn)物2 措施改變微生物細(xì)胞膜的通透性改變微生物的遺傳特性（誘變、重組等）控制發(fā)酵條件（如溫度、PH、O2等）,,NH4+,,抑制,葡萄糖,中間產(chǎn)物,α-酮戊二酸,谷氨酸,谷氨酸脫氫酶,

7、,,,,,,谷氨酸棒狀桿菌合成谷氨酸的途徑,,,通過(guò)調(diào)節(jié)酶的活性，控制代謝過(guò)程,微生物代謝的人工控制—— 改變膜的透性,改變細(xì)胞膜的透性，使谷氨酸迅速排放到細(xì)胞外面，解除谷氨酸的抑制作用。,,,抑制,天冬氨酸,中間產(chǎn)物Ⅰ,,,,,,中間產(chǎn)物Ⅱ,高絲氨酸,蘇氨酸,賴氨酸,天冬氨酸激酶,高絲氨酸脫氫酶,,,,,+,甲硫氨酸,黃色短桿菌合成賴氨酸的途徑,,,高絲氨酸脫氫酶,不能合成,可以大量積累,人工誘變不能產(chǎn)生高絲氨酸脫氫

8、酶的菌種,抑制,,,,微生物代謝的人工控制—— 改變遺傳特性,O2： 如：酵母菌在有氧條件下大量繁殖，在無(wú)氧條件下才大量產(chǎn)生酒精。 又如：谷氨酸棒狀桿菌在溶氧不足時(shí)，生成的產(chǎn)物是乳酸或是琥珀酸。C：N 如在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)培養(yǎng)基中C： N=4：1時(shí)，菌體大量繁殖而產(chǎn)生谷氨酸少；當(dāng)C：N=3：1時(shí)，菌體繁殖受抑制而合成谷氨酸多,微生物代謝的人工控制—— 改變發(fā)酵條件,,第四節(jié) 微生物的代謝途徑修飾,代謝工

9、程的目的通過(guò)重組DNA技術(shù)構(gòu)建具有能合成目標(biāo)產(chǎn)物的代謝網(wǎng)絡(luò)或具有高產(chǎn)能力的工程菌，并用于生產(chǎn)。代謝工程研究的設(shè)計(jì)思路1)提高通向目標(biāo)產(chǎn)物的代謝流;2)擴(kuò)展代謝途徑;3)構(gòu)建新的代謝途徑,一、改變代謝途徑加速限速反應(yīng)改變分支代謝途徑流向構(gòu)建代謝旁路改變能量代謝途徑,一、改變代謝途徑，提高通向目標(biāo)產(chǎn)物的代謝流加速限速反應(yīng)(通過(guò)關(guān)鍵酶的過(guò)量表達(dá)來(lái)解決代謝瓶頸) 將編碼限速酶的基因通過(guò)基因擴(kuò)增 ,增加拷貝數(shù) ,在

10、宿主中表達(dá)并增強(qiáng)催化限速反應(yīng)的酶的表達(dá)量或活性,從而提高代謝流。以實(shí)現(xiàn)目的產(chǎn)物產(chǎn)率的上升。經(jīng)典代謝工程主要過(guò)程:首先 ,必須確定代謝途徑中的限速反應(yīng)及其關(guān)鍵酶。然后 ,將編碼限速酶的基因通過(guò)酶切等手段 ,制得特定片段 ,連接在高拷貝數(shù)的載體上再導(dǎo)入宿主中去表達(dá),從而加速限速反應(yīng),提高目的產(chǎn)物產(chǎn)率。在頭孢霉素 C傳統(tǒng)的發(fā)酵過(guò)程中 ,青霉素N的積累表明下一步酶反應(yīng)是頭孢霉素合成代謝中的限速步驟 ,通過(guò)克隆編碼限速酶(脫乙?；^孢霉素合

11、成酶)基因 cefEF,再將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入頭孢霉素 C生產(chǎn)菌株頂頭孢( Cephalosporium acremonium)中 ,所得工程菌株的頭孢霉素C的產(chǎn)量提高了25 %,而青霉素N的積累量減少了15倍。,改變分支代謝途徑流向 在有競(jìng)爭(zhēng)途徑(如分支代謝途徑)存在時(shí),阻斷有害的或無(wú)關(guān)的競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑代謝產(chǎn)物的合成,從而達(dá)到改變代謝流,提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。高絲氨酸脫氫酶缺陷型(Hom2)賴氨酸工程菌芳香族氨基酸合成 頭孢

12、烷酸中 ,色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸三條支路上的任一條支路的酶活性被加強(qiáng) ,其與另兩條支路的競(jìng)爭(zhēng)將占據(jù)優(yōu)勢(shì)。日本 Katsumata Ryoichi 等人從谷氨酸棒桿菌 K86 中提取質(zhì)粒 pCDtrp157 ,該質(zhì)粒帶有DAHP合成酶基因和色氨酸合成酶基因。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒桿菌 KY9182(Phe2) ,使該菌可產(chǎn)色氨酸1.1 gΠL。若將苯丙氨酸合成相關(guān)的酶基因如 pheA 的基因克隆 ,則可使色氨酸生產(chǎn)菌轉(zhuǎn)化為苯丙氨酸生產(chǎn)菌

13、。,構(gòu)建代謝旁路高密度培養(yǎng)技術(shù)在發(fā)酵生產(chǎn)中，為實(shí)現(xiàn)大腸桿菌的高密度培養(yǎng),必須阻斷或降低對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用的有毒物的產(chǎn)生。大腸桿菌糖代謝末端產(chǎn)物乙酸達(dá)到一定濃度后明顯造成細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制, 人們應(yīng)用代謝工程的方法,將枯草桿菌的乙酰乳酸合成酶基 因克隆到大腸桿菌中,構(gòu)建新的代謝支路,結(jié)果明顯改變細(xì)胞糖代謝流,使乙酸處于較低水平,以實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)目的。,改變能量代謝途徑除了通過(guò)相關(guān)代謝途徑的基因, 改變能量代謝途徑或電子傳遞系統(tǒng)也可以有效

14、改變代謝流。 重組木糖發(fā)酵菌株 SaccharomycescerevisiaeTMB3001可以在含木糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng),但其用木糖產(chǎn)乙醇率很低, 一個(gè)重要原因就是菌體內(nèi)氧化還原作用輔因子的不平衡 。因此 Thomas TMB3001 CPB. CR4兩種 Saccharomycescerevisiae菌株,通過(guò) gdh1的敲除和 GDH2的過(guò)表達(dá),這二者不僅能發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇,而且被修飾了還原代謝系統(tǒng),C13標(biāo)記葡萄糖結(jié)果顯示氨同化作用

15、從利用 NADPH變?yōu)?NADH依賴的,同時(shí) CPB.CR4菌株的乙醇產(chǎn)率提高了25%。,二、擴(kuò)展代謝途徑通過(guò)基因工程手段在宿主菌中克隆、表達(dá)特定基因(簇)等,使原有代謝途徑進(jìn)一步向前或向后延伸,從而可利用新的原料用于合成目標(biāo)產(chǎn)物或產(chǎn)生新的末端代謝產(chǎn)物。外源基因的導(dǎo)入 ,通過(guò)擴(kuò)展代謝途徑可使宿主菌能夠利用自身的酶或酶系消耗原來(lái)不消耗的底物。Winter 等 克隆假單胞菌的單加氧酶基因并在大腸桿菌中表達(dá) ,獲得的工程菌可有效降解三氯乙

16、烯 ,降解力遠(yuǎn)大于原始菌株 ,可使三氯乙烯在水中的濃度降至 1/1000。這說(shuō)明關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)入不同的調(diào)控環(huán)境中其活性可大大增加。,三、轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑轉(zhuǎn)移代謝途徑 構(gòu)建新的代謝途徑一般是指引入外源基因(簇)來(lái)改造和修飾代謝網(wǎng)絡(luò),使細(xì)胞從不能合成某種代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蚝铣纱舜x產(chǎn)物。在真氧產(chǎn)堿菌(Alcaligenes eutrphus)一些細(xì)菌中于限制生長(zhǎng)和碳源過(guò)量條件下,在細(xì)胞內(nèi)大量累聚羥基丁酸(PHB)或聚羥基烷酸(P

17、HA) ,這些聚合物都具生物降解性能。為了利用大腸桿菌生產(chǎn) PHB ,有人將真氧堿菌的 PHB操縱子(包括編碼 PGB 多聚酶、硫解酶和還原的基因)克隆到大腸桿菌中,所構(gòu)建的工程菌和真氧產(chǎn)堿菌一樣,當(dāng)N源耗空時(shí)能積累大量 PHB ,可達(dá)細(xì)胞總量的50%。,構(gòu)建新的代謝途徑A）轉(zhuǎn)移代謝途徑,即將多個(gè)特定代謝途徑中的相關(guān)基因(簇)轉(zhuǎn)移到無(wú)這些基因的菌株中,從而達(dá)到使其能合成新的目標(biāo)產(chǎn)物的目的;Hopwood 等 將放線菌紅素(Actin

18、orhodin)的生物合成基因?qū)?Granaticin 和 Medermycin產(chǎn)生菌中 ,所構(gòu)建的工程菌可積累具有新結(jié)構(gòu)的抗生素Dihydrogranatirhodin 和 Mederrhodins A。b）將無(wú)關(guān)的代謝途徑相連,形成新的代謝途徑,從而合成新的目標(biāo)產(chǎn)物。,代謝工程的研究目的是要改進(jìn)微生物的代謝,增加工業(yè)生物產(chǎn)品的收率及生產(chǎn)能力。而如何從本質(zhì)上把握生物代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控規(guī)律，最終做到可以定量預(yù)測(cè)基因改變和環(huán)境變化后，

19、生物代謝網(wǎng)絡(luò)的變動(dòng)規(guī)律，從而為優(yōu)化生物代謝功能、提高研究和生產(chǎn)效率提供堅(jiān)實(shí)的理論支持和強(qiáng)大的技術(shù)后盾，是現(xiàn)代系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)待解難題，也是代謝工程的主要任務(wù)。,第五節(jié)微生物代謝工程的應(yīng)用最新進(jìn)展,1、微生物代謝工程的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：方向性強(qiáng)、目標(biāo)明確、效率高、技術(shù)手段先進(jìn)、過(guò)程可控性好和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)（微生物代謝工程在修飾靶點(diǎn)選擇、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及數(shù)據(jù)分析方面占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)）；主要缺點(diǎn)是對(duì)相應(yīng)微生物的代謝和遺傳機(jī)理知識(shí)以及基因操作工具的依賴性

20、太強(qiáng)。,應(yīng)用領(lǐng)域主要包括: (1)改善或提高微生物的某種性能; (2) 產(chǎn)生宿主細(xì)胞本身不能合成的新物質(zhì); (3)生產(chǎn)非天然的新物質(zhì)如新型藥物; (4) 對(duì)環(huán)境有害物質(zhì)的降解; (5)阻斷或降低副產(chǎn)物的生成; (6)提高菌體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力; (7)提高代謝產(chǎn)品生產(chǎn)速率和生產(chǎn)能力;,2、微生物代謝工程的最新應(yīng)用領(lǐng)域,,,藥物生產(chǎn)的代謝工程與定向進(jìn)化 ; 可再生資源利用的代謝工程;用代謝工程改進(jìn)染料生產(chǎn)及使用;乳酸