w章遺傳病診斷

1、,第十三章 遺傳病的診斷Diagnosis of Genetic Disease概述 臨床常規(guī)診斷 遺傳學(xué)檢測 現(xiàn)癥患者診斷 癥狀前診斷 產(chǎn)前診斷,,,第一節(jié) 現(xiàn)癥患者診斷 一、臨床常規(guī)診斷 （一）采集病史家史：親緣、婚姻關(guān)系 發(fā)病況 繪系譜 婚史:婚齡 次數(shù) 配偶況 近婚生育史：育齡 子女?dāng)?shù) 流、死產(chǎn)史 產(chǎn)傷 病毒感染（二）癥狀與體征1.智力低

2、下2.特殊面容,,3.特殊氣味4.耳聾5.肝脾腫大 糖原貯積病 半乳糖血癥 粘 多糖病 6.皮膚毛發(fā)異常7.肢體畸形 高 高大 矮 手足8.生殖器變化 ？9.生長發(fā)育遲緩（三）實驗室檢查和輔助檢查,,二 、 系譜分析(pedigree analysis)（一）系譜分析步驟：1.了解成員發(fā)病況2.繪制系譜 講方法……3.判斷遺傳方

3、式、基因型4.估計發(fā)病率5.處理意見注意： 準(zhǔn)確 完整 詳細(xì),,（二）孟德爾遺傳病1.AD、AR、XD、XR、YL2.注意事項 1） 外顯不全、隔代2）延遲顯性 3）新突變 4）遺傳異質(zhì)性 （多種遺傳方式）例：先天性聾啞 AR、AD、XR、環(huán)境 特發(fā) 先天性白內(nèi)障 CS畸變 AD、AR、胎內(nèi)感染 特發(fā),,（三）非孟德爾遺傳病1.mt遺傳病 母系遺傳 遺傳瓶頸 晚發(fā)、進行性2.多基因病

4、發(fā)病率比單基因病低（四）基因組印記與動態(tài)突變（略）,,三 、細(xì)胞遺傳學(xué)(cytogenetics)檢查（一）CS檢查1.CS檢查指征：1）智力低，生長發(fā)育遲緩，先天畸形；2）夫婦之一有染色體異常；3）家族中已有CS病患者；4）多發(fā)性流產(chǎn)婦女及其丈夫； 5）原發(fā)閉經(jīng)和女性不育；無精子癥和男性不育； 6） 35歲以上高齡孕婦 。,,7）兩性畸形者 8）身材高大，性情粗暴男性 9）惡性血液病患者10）長期接受X線

5、、電離輻射人員11）疑為先天愚型者；疑為脆性X綜合征者。2.CS顯帶分析（前述）（二）性染色質(zhì)檢查：性染色體數(shù)目異常。不分裂細(xì)胞：X染色體數(shù)=X染色質(zhì)數(shù)+1 Y染色體數(shù)=Y染色質(zhì)數(shù),,（三）熒光原位雜交（前述）（fluorescence in situ hybridization,FISH)用生物素或熒光素標(biāo)記探針 制備被測標(biāo)本 變性 分子雜交 熒光顯微鏡檢測

6、例1：21號CS著絲粒探針,,,,,例1,例2,,四、生物化學(xué)檢查（一）酶和蛋白質(zhì)的分析--確定單基因病 參表 利用血液和特定的組織，細(xì)胞對酶的活性和蛋白質(zhì)的含量進行檢測。主要方法有：電泳技術(shù)，酶活性檢測，層析技術(shù)，免疫技術(shù)，氨基酸順序分析技術(shù)等。（二）代謝產(chǎn)物的檢測--反映酶活性 利用血液、尿液和羊水對代謝產(chǎn)物進行質(zhì)和量的檢測。主要方法有：血液濾紙片法，顯色反應(yīng)。,五、 基因診斷 gene diagnosis

7、 采用分子生物學(xué)方法在DNA水平或RNA水平對某一基因進行分析，從而對特定的疾病進行診斷。 可基因診斷的疾病約1000種？,（一）基因診斷的基本技術(shù) *包括： 分子雜交技術(shù)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù) * DNA序列測定技術(shù)； 基因芯片技術(shù),,1.分子雜交技術(shù) （molecular hybridization）1）原理：變性成單鏈→復(fù)性成雙鏈（分子雜交）→基因診斷2）過程：制備探針并標(biāo)記

8、—分離靶DNA—變性處理--探針與靶DNA雜交—DNA或基因檢測3）概念：基因探針（Probe）：是一段帶有標(biāo)記的，與待測基因有關(guān)的核酸序列。探針種類: 基因組探針（genomic probe） cDNA探針（cDNA probe） 寡核苷酸探針（oligonucleotide probe）,4）基因診斷方法（1）斑點雜交法 又稱等位基因特異的寡核苷酸(ASO)探針雜交。 用人工合成的20

9、個堿基左右長度的ASO探針，一般要合成兩種探針：正常探針，突變探針。 將待測的細(xì)胞或DNA直接點在硝酸纖維膜或尼龍膜上，將標(biāo)記有同位素（或其他標(biāo)記）的變性探針與其進行雜交，通過放射自顯影，判斷受檢基因的有無以及基因的拷貝數(shù)，進行基因診斷。,ASO斑點雜交,1986年，胡流清等基于點突變原理，用寡核苷酸探針進行基因診斷。,,,（2）Southern 印跡雜交(略）（ Southern blotting hybridization

10、) 是經(jīng)分子雜交檢測DNA或基因突變的技術(shù)過程：切割——電泳——變性——轉(zhuǎn)移——80度烘烤固定——雜交——放射自顯影——觀察。（參下圖）,,（3）northern印跡雜交（northern bloting)是RNA雜交的常用方法。原理：應(yīng)用特異性基因探針分析基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄量的變異，mRNA的大小。過程:提取總RNA… p193(4)western印跡雜交(western bloting)是在蛋白質(zhì)水平檢測或研

11、究基因表達(dá)與功能的方法。過程:提取蛋白質(zhì)…p194(5)原位雜交（前述）,2.聚合酶鏈反應(yīng) （polymerase chain reaction，PCR） 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是在體外迅速的選擇性擴增特定的靶DNA的方法。PCR的原理：（1）合成引物：按靶DNA片段的5`和3`端的堿基順序各合成兩條引物（長約20個堿基的寡核苷酸）；（2）建立反應(yīng)體系：將待測DNA變性后，加入四種單核苷酸（dNTP），引物和耐熱DNA聚

12、合酶（Taq 酶）；,（3）反應(yīng)液進行熱循環(huán)：每一周期經(jīng)過變性（92-95℃），復(fù)性（40-60℃）和延伸（65-72℃）三個階段產(chǎn)生倍增的DNA。一般進行20-40個周期。,PCR相關(guān)技術(shù)及應(yīng)用：（1） PCR-ASO ：PCR/等位基因特異性寡核苷酸探針雜交PCR擴增 用ASO探針雜交 （2）PCR-RFLP：PCR-限制性片段長度多態(tài)性連鎖分析PCR擴增 限制酶酶切 電泳（3）RT-PCR：反轉(zhuǎn)

13、錄PCR 反轉(zhuǎn)錄酶 合成cDNA（4）多重PCR：用兩對以上引物 （5）PCR-SSCP：PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析在突變點附近設(shè)計引物—PCR擴增—突變DNA構(gòu)象變化—電泳分離—DNA測序 （6）PCR-DGGE （7）定量PCR,PCR-SSCP,1989年，Orita等建立的PCR產(chǎn)物單鏈DNA凝膠電泳技術(shù)。,1：正常人 2,4,5：純合體患者 3：雜合體(2的弟弟)左為泳動變位模式：a 正常人；b 純合體患者

14、,PCR-SSCP,3.DNA測序技術(shù)(DNA sequenceing Maxan和Gilbert首先建立了化學(xué)方法，Sanger建立了DNA測序的酶學(xué)方法。DNA自動測序法：以不同熒光色素標(biāo)記的四種不同脫氧核苷酸為原料進行酶促合成反應(yīng)，經(jīng)過凝膠電泳分離，應(yīng)用激光分析及計算機處理就能直接讀出堿基順序。而且測序的長度可以達(dá)到1000bp以上。,DNA測序（DNA Sequencing)是檢測未知突變和已知突變基因的最基本和最重

15、要的實驗手段。,4.基因芯片技術(shù) （gene chip)　基本原理：核酸雜交基本過程：將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，樣品DNA/RNA通過PCR擴增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子，然后按堿基配對原理進行雜交，再通過熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，并配以計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號做出比較和檢測，得出所要的信息。,,特點：是一種高效、準(zhǔn)確的DNA序列分析技術(shù)，可同時對千余種基因的表達(dá)

16、水平、突變、多態(tài)性進行檢測。例：β地貧檢測,（二）基因診斷的途經(jīng)和方法(略）1.途徑1)直接診斷 —— 檢測突變基因 直接診斷是直接檢測致病突變的基因。它通常使用基因本身或緊鄰的DNA序列作為探針，或通過PCR擴增產(chǎn)物，以探查基因有無突變、缺失等異常及其性質(zhì)，這稱為直接基因診斷，它適用已知基因異常的疾病。 當(dāng)致病基因的某種突變類型與發(fā)病有直接的因果關(guān)系,或者對致病基因以及分子機制已完全了解,或者對致病基因

17、以及分子機制部分了解但已知其中規(guī)律,可應(yīng)用此途徑。,2) 間接診斷 —— 基因連鎖分析 當(dāng)致病基因雖然已知但其異常尚屬未知或突變類型較多時；或致病基因本身尚屬未知時，但被檢測基因有緊密連鎖的DNA多態(tài)標(biāo)記，可以通過對受檢者及其家系進行連鎖分析，以推斷前者是否獲得了帶有致病基因的染色體。 連鎖分析多使用基因組中廣泛存在的各種DNA多態(tài)性位，特別是基因突變部位或緊鄰的多態(tài)性位點作為標(biāo)記。RFLP、VNTR、SSC

18、P、AMP－FLP等技術(shù)均可用于連鎖分析。,2.基因診斷的方法選擇： 各種遺傳病的基因異常是不同的，同一遺傳病也可以有不同的基因異常，但這些異常大體可分為基因缺失和突變兩大類型。根據(jù)對基因異常類型的了解，可以采用不同的診斷方法。,,遺傳的基因診斷方法基因異常 方法 探針、引物或限制酶基因缺失 基因組DNA印跡雜交\PCR擴增 缺失基因的探針

19、 引物包括缺失或在缺失部位內(nèi)點突變 RFLP分析\ASO雜交 突變導(dǎo)致其切點消失的限制酶 PCR產(chǎn)物的多態(tài)性分析 正常和異常的ASO探針 （RFLP、SSCP、DGGE） 引物包括突變部位基因已知 基因內(nèi)或旁側(cè)序列多態(tài)性

20、 基因內(nèi)或旁但異常不明 （RFLP、 SSCP、AMP－FLP） 側(cè)序列探針或引物 連鎖分析 基因未知 與疾病連鎖的多態(tài)性， 與疾病連鎖的多態(tài) 如SSCP、AMP－FLP連鎖分析， 位點探針或引物 RFLP位點單體型連鎖分析,,,（三）基因診斷在遺傳病診斷中的應(yīng)用1． 對單基因病的基因診斷（

21、1）點突變型遺傳病的基因診斷,①鐮形細(xì)胞性貧血的基因診斷ASO探針診斷法：,,RFLP診斷法：RFLP(restriction fragment length polymorphism): 不同人的DNA用同一種限制酶切割，可切出不同長度的片段。例：Hbs病β6 GAG（谷）→GTG（纈）MstⅡ可識別并切割βA:CCTGAGG序列 不能切割βs: CCTGTGG序列

22、 此切點消失,,,,,,IVS-Ⅰ,,,,,1.15kb,MstⅡ切點,,,,,,,,1.15kb,0.2kb,HbA,,,,1.35kb,A→T HbS,,,,,,,,1.15kb,1.35kb,0.2kb,,,,正常,雜和體,HbS病,失,②無過氧化氫酶血癥（acatalasemia) （略） 是一種常染色體隱性遺傳病，患者過氧化氫酶活性只有正常人的0.2%～0.4%，雜合體血液中過氧化氫酶活性則處于中間水

23、平。過氧化氫酶基因由13個外顯子和12個內(nèi)含子組成。應(yīng)用32P標(biāo)記PCR反應(yīng)中底物方法，擴增第4個外顯子和內(nèi)含子附近的203bp片段，應(yīng)用SSCP法可清楚地判斷患者和雜合體。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,aa/aa aa/- aa/a- a-/-- --/-,14kb10kb,,,,,10kb 4kb,BamH I,BamH I,左側(cè)：16號染色體上攜有數(shù)目不同的

24、基因右側(cè)：a基因探針雜交的結(jié)果,① ?-地貧基因缺失的診斷,正常,貧血癥狀,攜帶者,HbH,（2）基因缺失型遺傳病的診斷,RFLp診斷（略）：,,PCR診斷：（polymerase chain reaction ,)PCR原理（參下頁舉例）,950C → 560C →720C,變性 退火 延伸,,,,例：診斷Barts胎兒水腫綜合征。1）建立反應(yīng)體系 2）DNA擴增3）電

25、泳檢測,,待測DNA,α基因引物,dTNP,Taq酶,,,,,950C → 560C →720C,變性 退火 延伸,,,,,,,,,,,,α基因,②DMD／BMD的缺失型診斷：,（3）基因異常不明的遺傳病的診斷 以苯丙酮尿癥( PKU )的基因診斷為例。RFLP分析： p202上,一個PKU家系的RFLP單體型分析 （略）,（略）,單體型分析,,（略）,ASO Hybridization法：,,

26、PKU家系PAH基因STR連鎖分析（略）,2．多基因遺傳病的基因診斷（略） 人類基因組多態(tài)性是多基因病基因診斷的基礎(chǔ)，易感基因多態(tài)性的檢測能幫助我們理解多基因病發(fā)生的機制，有助于對疾病的診斷和分類。 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些多基因病相關(guān)基因，如載脂蛋白E基因（ApoE）的多態(tài)性與阿爾茨海默?。ˋD）有高度相關(guān)性，血管緊張肽轉(zhuǎn)換酶基因的多態(tài)性與原發(fā)性高血壓和心肌梗死高度相關(guān)。,3． 對腫瘤的基因診斷ras基因突變的檢測

27、 ras基因突變的檢測可采用PCR-ASO方法進行，已知ras基因突變的熱點在12、13及61密碼子。 p53基因的檢測 目前常用PCR法進行檢測p53突變的熱點是外顯子5-8，一般可先選用外顯子5-8的引物進行擴增，其后再進行突變位點的詳盡分析，甚至測序。另一初步檢測p53基因突變的方法為PCR-SSCP，然后測序。,（五）疾病基因診斷的展望未來的基因診斷主要發(fā)展方向 *胚胎著床前診斷—在囊胚8個細(xì)胞期，通過對其

28、中一個細(xì)胞的染色體核型分折和原位雜交，從而將人類的遺傳缺陷控制在最早期階段； *母體外周血中胎兒細(xì)胞分析技術(shù)； *對常見病、多發(fā)病如心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、精神疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、哮喘、近視眼等進行分子診斷。,第二節(jié) 癥狀前診斷（pre-symptomatic diagnosis） 指在遺傳病的臨床癥狀出現(xiàn)前所作的診斷。 是針對一些發(fā)病年齡延遲遺傳病 (AD、AR、XR等) 的診斷方法。這些個

29、體往往早期表型正常，延遲發(fā)病，如果能在出現(xiàn)癥狀之前作出診斷，可以早期治療，并避免將致病基因傳遞給后代，減少遺傳病的發(fā)病率。,癥狀前診斷方法有4種：1．家系分析法和風(fēng)險估計 2．生化學(xué)檢查3．基因分析 4. 新生兒篩查（neonatal screening）是對已出生的新生兒進行某些遺傳病的診斷，是出生后預(yù)防和治療某些遺傳病的有效方法。,,第三節(jié) 產(chǎn)前診斷（prenatal diagnosis)定義：產(chǎn)前診斷即宮內(nèi)診斷 生

30、前 遺傳病畸形、性別……一 、產(chǎn)前診斷的對象 1.夫婦之一有CS畸變。2.35歲以上高齡孕婦。3.夫婦之一有神經(jīng)管畸形或生過畸形兒。4.夫婦之一有先天代謝缺陷或生過該病患兒。5.有原因不明的習(xí)慣性流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)及新生兒死亡的孕婦。,,7.羊水過多。8.夫婦之一有致畸因素接觸史。9.有遺傳病家族史、近婚的孕婦。二 、產(chǎn)前診斷的方法1、X線：24周后 骨骼畸形。2、超聲波：無痛、無損傷。3、胎兒鏡：18-

31、20周 直接觀察 取材4、羊膜穿刺術(shù)（amniocentesis)：16-18周 取標(biāo)本（參下圖）5、絨毛吸取術(shù)(chorionic villus sampling)：7-9周,,非侵襲性,,,經(jīng)腹壁羊膜腔穿刺,,,經(jīng)腹壁取絨毛樣品,,經(jīng)陰道、子宮頸進入子宮絨毛樣品,,6、臍帶穿刺術(shù)：約18周。胎血取樣。7、孕婦外周血分離胎兒有核紅細(xì)胞：前景 胎兒游離DNA 無創(chuàng)性8、母體血清三項篩查： Down綜合征：AFP

32、↓uE3↓HCG↑9、實驗室檢查 染色體 生化 基因 10、植入前診斷（preimplantation genetic diagnosis,PGD) ：植入前體外受精、培養(yǎng)、檢測。 過程：體外受精、培養(yǎng)—8細(xì)胞時胚胎組織微活檢—染色體、基因檢測—據(jù)結(jié)果決定是否培養(yǎng)與移植。 前景,,第四節(jié) 皮膚紋理分析(略）概述皮紋—手指、掌面、足趾、（足/庶）面的嵴紋和溝紋走向的不同形成的皮膚紋理。人胚12~13周

33、一卵雙生 0.953 多基因遺傳 終生性輔助診斷手段（一）正常皮紋1.指紋 指端部的皮紋1）弓形紋（arch,A)特點：嵴紋由一側(cè)走向另一側(cè),,2）箕形紋（loop,L)特點：嵴紋從一側(cè)發(fā)出，折回原側(cè)，有一三叉點尺側(cè)～ 橈側(cè)～3）斗形紋(whorl,W)特點：兩個三叉點圖 環(huán)形斗 螺形斗 絞形斗,,4)總指嵴紋數(shù)Total finger ridge count,

34、TFRC)十指嵴紋總數(shù)2.掌紋1）指間花紋2）大、小魚際花紋3）主線式A 、B 、C 、D主線A→小魚際4）t三叉與atd角正常人 1.4cm 410 掌紋圖,,3.手掌褶與指褶（1）手掌褶（圖→）1）正常2）通貫手（遠(yuǎn)近合一）正常人4%±3）變異Ⅰ型4）變異Ⅱ型5）悉尼手（2）指褶小指有意義,,4.拇趾球部皮紋7形：斗、遠(yuǎn)側(cè)箕、腓箕、脛箕、近弓、腓弓、脛弓

35、（二）皮紋檢查方法（三）CS病患者皮紋特點1. Town syndrome (唐氏綜合征)1）∠atd＞600 (82%)2) 脛弓（72%） 3）通貫手（31%）4）小指只一指褶（17%）5）箕↑、弓↑、TFRC↓,,,,,,,脛弓,,,2.18三體綜合征（1）弓紋↑（80% 7↑）（2）小指1指褶（40%）（3）通貫手（25%）（4）∠atd＞700 （25%） 3.13三體綜合征 （1）弓紋↑（2