二乙酰一肟法測定血清尿素

1、實驗一：二乙酰一肟法測定血清尿素,,一、實驗?zāi)康?.掌握血清尿素的測定原理和方法。2. 了解尿素測定的參考范圍及臨床意義。,二、實驗原理 尿素（urea）在強(qiáng)酸、加熱的條件下，與二乙?？s合生成紅色的二嗪化合物（Fearon反應(yīng)），其顏色深淺與尿素含量成正比。與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)液在540nm處比色，求得尿素含量。由于二乙酰不穩(wěn)定，一般由二乙酰一肟與強(qiáng)酸作用產(chǎn)生。其反應(yīng)式如下：,,,,(無色),(粉紅色),1、主要器具

2、,微量移液器,三、器材,,試管與試管架,三用水浴箱,紫外可見分光光度計,四、試劑,1.酸性試劑　離子水約100ml、濃硫酸44ml、85%磷酸66ml、氨基硫脲50mg及硫酸鎘(CdSO4·8H2O) 2g。2.二乙酰一肟溶液　3.尿素標(biāo)準(zhǔn)貯存液(100mmol/L)　4.尿素標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(5mmol/L),五、操作步驟,取試管7支，按下表操作,,混勻后，置沸水浴中加熱12min，取出置冷水中冷卻5min，波長540nm，

3、空白管調(diào)零，分別讀取各管吸光度 。,標(biāo)準(zhǔn)管,測定管,,,,,沸水浴中加熱12min,冷水浴中冷卻5min,,,標(biāo)準(zhǔn)管,測定管,六、計算,,,（A為吸光度值，取平均值）,參考范圍：1.78~7.14mmol/L,mmol/L,七、注意事項,1.血標(biāo)本應(yīng)及時處理，以防尿素酶水解尿素。最好血標(biāo) 本加草酸鉀或氟化鈉抗凝以抑制尿素酶。2.本法試劑單一，方法簡便，但試劑具毒性和腐蝕性。 3.煮沸時間和煮沸時液體蒸發(fā)量影響結(jié)果。因此測定和

4、 標(biāo)準(zhǔn)管的試管口徑和煮沸時間應(yīng)盡量一致。煮沸時間 延長吸光度反而降低。,,4.顯色反應(yīng)產(chǎn)物對光不穩(wěn)定，加入氨基硫脲和Cd2+能增加顯色穩(wěn)定性和顯色強(qiáng)度，但仍有輕度褪色現(xiàn)象(＜5%/h)，故顯色冷卻后宜在20～30min比色完畢。5.尿液中尿素也可用此法測定，但因濃度高，需先用去離子水作50倍以上稀釋。,八、臨床意義,1．血液尿素濃度增高 分生理性和病理性因素兩方面。生理因素： 高

5、蛋白飲食引起血清尿素濃度和尿液排出量顯著增高。血清尿素濃度男性比女性平均高0.3～0.5mmol/L，隨年齡增加有增高傾向。成人日間生理變異平均為0.63mmol/L。,(2) 病理因素1) 腎前性疾?。鹤钪匾脑蚴鞘蜓簼饪s使腎血流量減少，腎小球濾過率減低而致血液尿素濃度增加。2) 腎性疾?。耗I小球腎炎、腎病晚期、腎功能衰竭、慢性腎盂腎炎及中毒性腎炎等影響腎小球濾過的疾病，都可使血液尿素含量增高。,,3) 腎后性疾病：所

6、有使尿路阻塞的因素都可引起血液中尿素含量增高,如前列腺腫大、尿路結(jié)石、尿道狹窄、膀胱腫瘤致使尿道受壓等。2.血清尿素濃度降低 除嬰兒、孕婦以及低蛋白高糖飲食者外,常見于肝功能衰竭患者。,九、方法學(xué)評價,1．本法試劑單一，方法簡便，但試劑具毒性和腐蝕性。在標(biāo)本數(shù)量多時加熱開始難以達(dá)到100℃,各管間受熱溫度也可能不一致,因而本法重復(fù)性不佳.若改善加熱條件,如采用在水浴鍋底部加置高約5mm的網(wǎng)墊,在網(wǎng)墊上加熱顯色,可使

7、CV由不加網(wǎng)墊時的6.46%降至2.99%。2．線性上限僅達(dá)7.14mmol/L；回收率為96%～102.1%。,,3．二乙酰一肟法的主要干擾來自血清中存在的含氮化合物。很多其它化合物在結(jié)構(gòu)中會有尿素的殘基，如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素，雖然也會產(chǎn)生一種帶顏色的產(chǎn)物，但這些化合物在血清中濃度很低，故很少引起明顯的干擾。另一些其它的化合物在血清中濃度高，但這些色素的最大吸收峰不同，因此不產(chǎn)生明顯干擾。膽紅素達(dá)171μmol/L、血紅蛋白達(dá)