細胞化學(xué)染色課件

1、第二節(jié) 細胞化學(xué)染色檢驗,瑞氏染色的原理,瑞氏染料中含有堿性亞甲藍和酸性伊紅兩種成分,它們與細胞內(nèi)的各種物質(zhì)具有不同的親和力,使其顯現(xiàn)出不同的色調(diào),以利辨認.,1.細胞核是由核糖核酸與強堿性的組蛋白,精蛋白形成核蛋白,與酸性染料伊紅有親和力,染成紅色.2.幼稚細胞的胞質(zhì)和核仁含有酸性物質(zhì),與堿性染料亞甲藍有親和力,染成藍色.主要的鑒別點:酸堿性,各種原始細胞的鑒別,定義：,細胞化學(xué)染色是細胞學(xué)和化學(xué)相結(jié)合的一門科學(xué)。它是

2、以細胞形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，根據(jù)化學(xué)反應(yīng)的原理、應(yīng)用涂片染色的方法觀察細胞的化學(xué)成分及其變化的重要方法。,各種類型血細胞的化學(xué)成分（酶，脂，糖，蛋白，核酸）,分布及其量不完全相同,在病理情況下,血細胞的成分可發(fā)生改變.研究的對象：細胞和組織中的化學(xué)物質(zhì) 研究的方法：根據(jù)細胞和組織中化學(xué)物質(zhì)的有無以及強弱判斷血細胞類型以及是否發(fā)生異常.,細胞化學(xué)染色的臨床應(yīng)用,1、 輔助診斷急性白血病的細胞類型（不同系別，不同階段的細胞所含化學(xué)物質(zhì)不同

3、）； 2、 輔助血液系統(tǒng)疾病的診斷和鑒別診斷（IDA、 CML與類白）。,一、鐵染色,原理： 正常人骨髓中的儲存鐵主要存在于骨髓小粒和幼紅細胞中。骨髓小粒中的含鐵血黃素稱細胞外鐵，其中的三價鐵與分子中的蛋白質(zhì)結(jié)合不牢，經(jīng)稀鹽酸處理后而游離，并能在酸性亞鐵氰化鉀溶液中產(chǎn)生普魯士藍反應(yīng)。細胞內(nèi)鐵也可用此法顯示。根據(jù)反應(yīng)的強弱了解骨髓中鐵的含量。,細胞內(nèi)鐵：中、晚幼紅細胞胞漿中有藍綠色顆粒,為鐵蛋白.鐵粒

4、幼細胞：胞質(zhì)內(nèi)有藍綠色顆粒的幼紅細胞.環(huán)鐵粒幼紅細胞：胞質(zhì)內(nèi)有藍綠色顆粒在6個以上，并圍繞于核周排列成環(huán)形者，超過1/2區(qū)域.細胞外鐵：正常骨髓以含鐵血黃素形式儲存的鐵，主要存在骨髓小粒的巨噬細胞的胞質(zhì)內(nèi)或外。正常情況下 +~++,細胞外鐵反應(yīng)強度的判斷標準：,顯微鏡檢查 肉眼觀察 ———————————————— 著色

5、程度 形態(tài)大小 分布情況 ———————————————— 陽性 顯色不明顯 淡染 小 稀疏（+~++） （綠~藍） （顆粒~小珠）（星狀排列） 強陽性 顯色明顯 深染

6、 大 密集（+++~++++） （藍~黑） （大珠~成堆） （片狀分布） ————————————————,++++,+++,++,+,--,環(huán)形鐵粒幼細胞,環(huán)形鐵粒幼細胞,參考值 1、細胞外鐵：（＋）～（＋＋） 2、細胞內(nèi)鐵：觀察100個幼紅細胞,計算出鐵粒幼紅細胞百分比,陽性率為12

7、％～44％,無環(huán)形鐵粒幼紅細胞和鐵粒紅細胞。,鐵的生成和利用,食物中的鐵經(jīng)吸收后在單核吞噬系統(tǒng)內(nèi)儲存, 鐵通過幼紅細胞表面的鐵受體,轉(zhuǎn)至幼紅細胞內(nèi),與原卟啉結(jié)合形成血紅素.細胞外鐵:單核吞噬系統(tǒng)內(nèi)的鐵,反映骨髓的儲存鐵 細胞內(nèi)鐵:幼紅細胞和紅細胞內(nèi)的鐵,骨髓可以利用的鐵.,幾種病理情況,,1.體內(nèi)鐵攝入不足或消耗過多:骨髓細胞內(nèi)外鐵均減少或消失(IDA) 2.鐵利用障礙:幼紅細胞線粒體合成血紅素功能障礙,為鐵失利用,內(nèi)

8、外鐵均增加(鐵粒幼細胞性貧血) 3.鐵儲存于單核吞噬細胞內(nèi)不能被釋放入幼紅細胞內(nèi),為鐵失利用,外鐵增加,內(nèi)鐵減少(慢性炎癥貧血),疾病鑒別意義：,缺鐵貧：外鐵明顯下降，甚至消失；內(nèi)鐵下降,鐵粒幼細胞減少。經(jīng)鐵劑治療后，鐵增加.鐵粒幼細胞貧血：內(nèi)、外鐵增加，且出現(xiàn)環(huán)鐵粒幼紅細胞增多,有時可見鐵粒紅細胞.,感染、肝硬化、慢性腎炎、尿毒癥、惡性腫瘤：外鐵增加,內(nèi)鐵減少。骨髓增生異常綜合癥:環(huán)形鐵粒幼細胞大于有核紅細胞的15%,細胞外

9、鐵也常增加.,二、中性粒細胞堿性磷酸酶染色（NAP）,原理:成熟中性粒細胞內(nèi)的AKP在PH 9.4~9.6緩沖液中能水解基質(zhì)液中的α-磷酸柰酚，產(chǎn)生α-奈酚，其與重氮鹽偶聯(lián)，形成不溶性灰黑色偶氮染料沉淀，定位于酶活性處。AKP主要存在于中性成熟粒細胞內(nèi),其他細胞基本陰性.,陽性程度：,- —— 胞漿中無紫黑色顆粒 + —— 胞漿中有一層棕黑色不透明或局限地方有紫黑色顆粒(約1/4) ++—— 胞漿中顆粒占胞漿1/2或

10、遍布整個胞漿，但較疏松 +++—— 胞漿中顆粒占3/4，顆粒染色濃 ++++——僅見核影，其余均是黑色,1.陽性率計算: 100個中性桿狀,分葉核粒細胞中陽性細胞總數(shù).,結(jié)果統(tǒng)計:,2.AKP積分的計算,積分：-——0分 舉例：細胞數(shù) 積分 +——1分 5 5*0——0

11、 ++——2分 5 5*1——5 +++——3分 10 10*2——20 ++++——4分 20 20*3——60

12、 60 60*4——240 —————————— AKP積分總分為325 參考范圍：30~130分,參考值： 陽性率 ﹤40% 積分值 30～130分,生理變化： AKP活性和年齡有關(guān)，新生兒、嬰幼兒高于成年人，老年人略低,應(yīng)激狀態(tài)下增加。病理變化： （1

13、）增高 細菌感染、AA、類白血病、急淋、骨髓纖維化,真紅,慢淋,血小板增多癥,惡性腫瘤等 （2）減低 急慢粒、PNH、MDS、惡組,病毒感染等,臨床意義:,1.慢粒(無繼發(fā)感染時)——積分明顯下降 中性粒細胞類白血病——積分可大于200 2.細菌感染——NAP積分增加 病毒性感染——無明顯變化（感染癥狀相似）3.急性白血病類型的鑒別： 急?！?NAP明顯減低 急淋—

14、— NAP增高 急單—— NAP正?；驕p低,4.再障與PNH的鑒別 再障—— NAP增高 PNH —— NAP減低,慢粒與中性粒細胞性類白血病反應(yīng)的鑒別,三、過氧化物酶染色（POX）,原理： 細胞內(nèi)的過氧化物酶能將底物的過氧化氫分解，產(chǎn)生新生氧。后者將試劑中的聯(lián)苯胺氧化為聯(lián)苯胺藍，再與亞硝基鐵氰化鈉結(jié)合，進而生成棕黑色化合物沉淀于酶的所在部位。,結(jié)果判斷:,1.陰性：細胞胞漿中無藍色顆粒2.陽性：細胞

15、胞漿中出現(xiàn)藍色顆粒者。,陽性程度參考標準:,-:無顆粒沉著+/-:顆粒細小,分布稀疏+:顆粒較粗,常呈局灶性分布++:顆粒粗大,分布較密,占胞漿1/2-2/3+++:顆粒粗大,成團塊狀分布++++:顆粒布滿整個細胞,可覆蓋胞核,正常情況下：,粒系：原?！缬琢！杏琢！墒炝＜毎?多數(shù)（-） （+） 陽性程度逐漸增強 嗜酸陽性最強；嗜堿（-）單核系：

16、原單——幼單——成熟單核細胞 （-） （弱+） 陽性顆粒細少而分散其他細胞:淋巴細胞,紅細胞,巨核細胞（-）,有時吞噬細胞可呈陽性反應(yīng),疾?。?急粒（AGL）——原粒陽性或陰性,常為陽性（顆粒較粗大，呈局灶分布）,為+~++急早幼粒（APL） ——呈強陽性反應(yīng)（++~+++）急單（AML）——原單,幼單多數(shù)陰性或弱陽性（顆粒細小、稀少、散在分布）,急淋（ALL）——陰性。各階段淋巴細胞POX均呈（-）反應(yīng)

17、，ALL骨髓中殘留的原粒細胞POX可為（+），但比例小于3%。急性紅白血病——原始粒細胞陽性或陰性,原單陰性或弱陽性,有核紅陰性,應(yīng)用：,是急性白血病形態(tài)學(xué)分型中最重要,首選的常規(guī)化學(xué)染色.,對急淋和急非淋做出判斷，陽性率大于5%診斷為髓系，小于3%不能排除淋巴系。區(qū)別小型原始粒細胞和原淋鑒別急性非淋巴細胞性白血病的各亞型（M1與M5的鑒別）。鑒別急單（陽性~弱陽性）和異常組織細胞（陰性）,四、過碘酸－雪夫反應(yīng)（糖原染色PAS

18、）,原理： 多糖類物質(zhì)中的1，2-乙二醇基經(jīng)過碘酸氧化后產(chǎn)生醛基，此醛基進而與雪夫 (Schiff) 液作用，使無色品紅變?yōu)榧t色的化合物，定位于胞漿中。,正常情況下:,1.粒系：原?！缬琢！墒炝＜毎?（-） （+） (+++)隨細胞成熟，陽性程度逐漸增強，陽性為彌散性，細顆粒狀 嗜酸（-）；嗜堿（+

19、）2.單核系：原單——幼單——成熟單核 （-） （+） （+~++） 陽性為細顆粒狀，有時細胞邊緣顆粒較粗大,3.紅系： 幼紅——成熟紅細胞 （-） （－）4.淋巴系： 小部分（－），多數(shù)呈（+），陽性率小于20％，陽性為粗大顆粒狀或塊狀5.巨核細胞和血小板：（+）呈顆粒

20、狀或塊狀,疾?。?(一)白細胞系統(tǒng) 1.有助于急性白血病類型的鑒別 急淋——原始淋巴陽性率升高，粗顆?；驂K狀 急粒——部分原始粒陽性，細顆粒或彌散分布 急單——原幼單可陽性，細顆粒 巨核細胞——粗顆粒或塊狀強陽性，協(xié)助ANLL（M7）的診斷 2.慢淋——陽性率增加，粗顆?；驂K狀,(二)紅細胞系統(tǒng),1.紅白血?。∕6），MDS有核紅可陽性2.各類貧血的鑒別： 缺鐵貧、地貧——幼紅可呈（+） AA、溶貧、巨幼貧——

21、（-）,(三)其他：,幫助確認一些特殊細胞 1.不典型巨核細胞——強陽性 淋巴瘤RS細胞——陰性 2.戈謝細胞——強陽性 尼曼皮克細胞——弱陽性~陰性 3.白血病細胞 腺癌骨髓轉(zhuǎn)移的癌細胞——強陽性紅 色細顆粒、粗顆?；驂K狀,五、α-醋酸萘酚酯酶染色 （非特異性酯酶染色

22、α- NAE）,原理： 血細胞內(nèi)的α-醋酸萘酚酯酶將基質(zhì)液中的α-醋酸萘酚水解，產(chǎn)生α-萘酚， 萘酚再與重氮鹽偶聯(lián)，形成不溶性有色沉淀，定位于胞質(zhì)內(nèi)酶所在的部位。 α-醋酸萘酚酯酶存在于單核細胞、粒細胞及淋巴細胞中，單核細胞的陽性可被氟化鈉抑制。,結(jié)果判斷：,油鏡計數(shù)100個細胞，分別計算出陽性率和陽性積分以及抑制率 抑制前陽性率-抑制后陽性率

23、 或陽性積分 或陽性積分抑制率%= ————————————% 抑制前陽性率或陽性積分,正常情況下：,粒系——各期粒細胞為陰性反應(yīng)，少數(shù)可弱陽性，不被NaF抑制單核系——原單（-）或（+），幼單~單核陽性，被NaF抑制淋巴系——多數(shù)陰性，少數(shù)弱陽性，不被抑制紅系——少數(shù)幼紅可陽性，不被抑制巨核、血小板——陽性，不被抑制,疾病情況下:,—

24、————————————————————————— 急粒 急早幼粒 急單 急淋ASDAE 原?？沙?白血病早幼粒細胞 白血病細胞 原淋和幼淋 （+）反應(yīng) （+）強陽性 呈（+）較強 細胞呈陰性

25、 或弱陽性NaF抑制 不被抑制 不被抑制 被抑制 不被抑制

26、 —————————————————————————,細胞化學(xué)染色,,急淋 急粒 急單 過氧化物酶 (－) 分化差的原始細胞(-)~(+) (－)~(+) (POX) 分化好的原始細胞(+)~(++

27、+) 糖原染色 (+) (－)或(+) (－)或(+) (PAS) 成塊或顆粒狀 彌漫性淡紅色 彌漫性淡紅色 非特異性脂酶 (－) (－)或(+)