藥物分析方法學驗證中各項指標的深度剖析

1、藥物分析方法學驗證中各項指標的深度剖析,一、線性試驗,主成分含量測定 以測定濃度為100% ，50%~120%之間選取5個點即可。 溶出（釋放）度測定 以釋放量的10%～120%間選取5個點即可。 雜質(zhì)含量用雜質(zhì)對照品準確測定 以雜質(zhì)限度為100% ，50%~120%之間選取5個點即可。,測定結(jié)果：1）闡述如何看待截距和斜率、如何應用。2）誤差在哪里，應用時的注意事項。3）為什么沒有不成線性

2、的？通常C、H、O、N結(jié)構(gòu)，紫外監(jiān)測器決定。 個別化學鍵所致。梯度洗脫時，有時會出現(xiàn)不成線性。4）都成線性、為何還要做？最小二乘法的原理知曉。,唑 來 磷 酸 結(jié) 構(gòu) 式,引申使用：1）有關物質(zhì)測定 歸一化法和自身對照法的相互妙用。2）緩釋制劑溶出度測定，對照品濃度設定為中間濃度。舉例說明。3）回收率試驗為何做80%~120%即可？亦及樣品濃度與對照品濃度接近到何等程度的理解。4）國內(nèi)只注重相關系數(shù)，不注重截距

3、。,二、精密度試驗,重復性試驗：連續(xù)進樣6次。 中間精密度試驗和重現(xiàn)性試驗通過“耐用性試驗中的溶液穩(wěn)定性試驗”來體現(xiàn)。 濃度極低時才會不理想，加大進樣量。 色譜峰形極為重要，對稱性、柱效等參數(shù)。加大柱溫、增加流動相中有機相比例，使被測物質(zhì)峰盡快出峰。,三、準確度試驗 用回收率來衡量,作法：在80%~120%間選擇3點或5點，原因是由外標一點法決定的。 已知雜質(zhì)、且有雜質(zhì)對照品的，可采用加入法，即加樣

4、回收率來評價。 一般情況下，只要空白輔料無干擾，回收率均是良好的！,四、專屬性,有關物質(zhì)為主，其他檢測項目（含量）基本上均參照有關物質(zhì)。 有關物質(zhì)的驗證，采用中間體和降解產(chǎn)物（確認結(jié)構(gòu)后人工合成）來驗證與主成分的分離。,系統(tǒng)適用性試驗的配制方法： 在100％濃度的主成分溶液中加入1%濃度的雜質(zhì)對照品，以模擬樣品中有可能存在的狀態(tài)。 介紹配制方法 —— 先配制雜質(zhì)貯備液，再用

5、供試品溶液（或濃的對照品溶液）來稀釋，簡便、易行！,專屬性試驗驗證圖譜,存在問題 —— 配制相同濃度，測定樣品時，主成分峰驟然加大，將雜質(zhì)峰覆蓋。 強破壞試驗的目的： 驗證藥品在遭遇了極端的氣候環(huán)境條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)，在所建立的色譜條件下是否能夠分離、測定。,● 檢測波長的確定 涉及到各被檢測物質(zhì)在該波長下的響應因子是否相同，即所謂重量校正因子的問題。（f=A雜質(zhì)/A被測成分） 選取主成分與各雜質(zhì)具有相同

6、紫外吸收的波長（f=1.0）。 選取各雜質(zhì)紫外吸收大于主成分紫外吸收的波長（f>1.0），這樣可更加嚴格控制雜質(zhì)的限度。 如選取各雜質(zhì)紫外吸收小于主成分紫外吸收的波長，應必須加入重量校正因子（f<1.0），否則將得到錯誤的判斷。,介紹該項檢測的由來和歷史背景 要看主峰里是否有雜質(zhì)，如何判斷？但需注意DAD檢測器的局限性，介紹“土辦法”！ 結(jié)果：目前從來沒有推翻現(xiàn)行色譜條件的。

7、意義在哪里。如何應用，拿到只是“走形式”？,最小峰面積的設定● 其設定，不是絕對值，而是相對值?！?英國藥典中有明確的說明：凡有關物質(zhì)的檢測采用HPLC法測定時，均規(guī)定舍棄對照溶液主峰面積幾分之幾的峰面積。普通樣品測定時，通常為1/10~ 1/20（即相當于樣品測定濃度的0.1%~0.05%）。如規(guī)定雜質(zhì)限度為1.0%，對照溶液峰面積為10000，那么，最小峰面積可考慮設定為1000~500左右。新藥穩(wěn)定性考核時，可設定到0.0

8、1%的最小峰面積?！?原料藥銷售與購買的合同中，為確保雙方達成一致意見，此點應予以重視。,強力破壞試驗● 水破壞 取原料適量，加水溶解后，在90℃放置24小時?！?氧化破壞 取原料適量，用5%過氧化氫溶液溶解后，在90℃放置24小時?！?強堿破壞 取原料適量，用1mol/L氫氧化鈉溶液溶解后，在90℃放置24小時。● 強酸破壞 取原料適量，加1mol/L鹽酸溶液溶解后，在90℃放置24小時?！?高溫破壞 取原

9、料適量，依據(jù)各自品種的熔點不同，在高溫下破壞至外觀性狀改變● 強光破壞 取原料適量，置紫外燈下照射48小時。,四、檢測限,● 信噪比的三倍 —— 純屬“紙上談兵”，實際測定中根本用不上?！?是相對值，不是絕對值。是相對于供試品溶液濃度的多少分之一而言，一般至少要在5000倍以上。,有關物質(zhì)、含量與自身對照三者濃度的關系,積分參數(shù)的設定● 積分參數(shù)的設定是非常重要的。由斜率(Slope)、峰寬(Width)、最小峰面積(

10、Min Area)組成?！?采用自身對照法時，對照溶液與供試品溶液必須在同一斜率、峰寬下進行積分計算?！?供試品溶液最小峰面積的設定將直接導致測定結(jié)果。設定得太小，會導致很多小峰甚至是基線漂移的小峰均被積分出作為雜質(zhì)峰，從而導致雜質(zhì)峰面積增加，易判斷為不合格；如設定得過大，又將反映不出雜質(zhì)情況。,方法學認證中的耐受性試驗 是指更換試驗因素，如不同人員、不同儀器，不同色譜柱型號、廠家，不同試劑等因素。這一點才是真正至

11、關重要的！認證時不可能做到這一點，出現(xiàn)問題時往往要考慮到。,方法學認證中溶液穩(wěn)定性的全面判定不能單從主成分入手！還要注意所有組分的百分比變化，絕對值變化！,流速、柱溫與溶劑的選擇● 在測定時通常調(diào)節(jié)流速使主成分保留時間稍長些，且使主成分峰不拖尾即可?！?柱溫對分離效果的影響雖有一定的影響，但不甚顯著，如有柱溫箱，通常設定不超過35℃?！?溶劑的選擇應測定樣品溶液在該溶劑中的穩(wěn)定性來衡量，盡量勿選擇揮發(fā)性強的溶劑；同時應保

12、證對照溶液的主成分峰面積精密度良好。,質(zhì)量標準中制訂有關物質(zhì)的原則● 采用雜質(zhì)對照品法、用于降解產(chǎn)物的準確測定，如氫氯噻嗪、對乙酰氨基酚等?！?采用強破壞試驗破壞出雜質(zhì)。如中國藥典中的氧氟沙星所有品種，均在HPLC法的色譜條件下擬定了：取供試品溶液，置紫外燈下（254nm）照射4小時以上，使產(chǎn)生的緊鄰主峰前的雜質(zhì)峰與主峰的分離度應符合規(guī)定。● 不采用任何方式。,典型強破壞試驗圖譜,藥品含量測定方法的設計——原料藥,原料藥:對

13、于組份單一的原料藥,首選容量法測定含量 強調(diào)：（1）供試品的取用量應滿足滴定精度的要求（消耗滴定液約20ml）；（2）滴定終點的判斷要明確，如選用指示劑法，應考慮其變色敏銳，提供滴定曲線，并用電位法校準其終點顏色。（3）為排除因加入其它試劑或混入雜質(zhì)對測定結(jié)果的影響，或便于剩余滴定法的計算，可采用“將滴定的結(jié)果用空白試驗校正”的辦法；（4）最后要給出滴定度（采用四位有效數(shù)字）。,容量法測定含量要注意參加反應的應是藥物分

14、子活性部分，而不應是次要的酸根或堿基部分。 如鹽酸氨溴索 ，有研究者采用氫氧化鈉滴定液測定其含量，事實上這種方法測定的是其中鹽酸的含量，由于其成鹽工藝中的酸、堿配比不當時，可嚴重影響成品酸堿度，故測定結(jié)果并不能代表其活性成分有機堿的含量 。 應采用非水滴定法，以無水冰醋酸為溶劑屏蔽掉鹽酸的干擾，用高氯酸滴定其有機堿的含量。高氯酸非水滴定法因適應性廣（適用于有機弱堿及其鹽類）在化學原料藥的含量測定中較為常用。,如用容量法

15、不適宜時，可考慮選用HPLC法，尤其在有關物質(zhì)干擾，或多組份物質(zhì)時，具有特殊優(yōu)勢。一般不選用UV法，尤其不首選“吸收系數(shù)法”定量，不選用末端吸收峰作測定波長；須用UV法時，可采用不受儀器及其它變化影響的“對照品比較法”定量，測定溶液的吸收度宜在0.3～0.7間。元素測定法如定氮法，在其它方法均不適宜時可采用，但因不能反映化合物含量的變化情況，此法不可用于穩(wěn)定性考察中。,藥品含量測定方法的設計——制劑,應考慮輔料等的干擾，首選方法

16、一般為HPLC法，在有關物質(zhì)、輔料不干擾的情況下，也可選用UV法或原料藥項下的容量法 。復方制劑首選HPLC法 。,藥品含量測定方法的設計——驗證,訂入質(zhì)量標準的含量測定法不同于一般質(zhì)量考察的方法，須經(jīng)過嚴格的方法學驗證 。容量分析法的驗證：①精密度：用原料藥精制品（含量>99.5%）考察方法精密度，平行試驗5個樣本的RSD≤0.2%；②準確度：以測定原料精制品的回收率計算，應在99.7%～100.3%之間（n＝5,RSD≤

17、0.1%）；③滴定終點確定的依據(jù)：包括滴定曲線的繪制，如用指示劑法確定終點，應用電位法校準終點顏色，提供指示劑顏色與電位變化情況的對比結(jié)果；,④耐用性：考察測定條件（供試液穩(wěn)定性、樣品提取次數(shù)、時間等）有微小變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，如測試條件要求苛刻時則應在方法中注明。 HPLC法的驗證：①精密度：RSD≤2%（n＝5）；②準確度：用于制劑時，要考察輔料的影響，將一定量藥物加到按處方比例配制的輔料中（為標示量的80%～1

18、20%）制成高、中、低三個劑量，混合均勻后，每個劑量取三份樣品，按擬定方法測定回收率，應在98%～102%之間（n＝9, RSD≤2%）。,③線性范圍：用已知含量的精制品配制一系列濃度的溶液（n＝5～7），用濃度C對峰面積A或峰高h或被測物的響應值之比進行回歸處理，線性方程的相關系數(shù)r≥0.9990，截距越小越好，并提供線性關系圖；④專屬性：輔料、有關物質(zhì)或降解產(chǎn)物峰對主藥峰應無干擾；⑤耐用性：考察測定條件（供試液穩(wěn)定性、流動相組成

19、和pH值、不同品牌或批號的同類色譜柱、柱溫、流速、樣品提取次數(shù)、時間等）有微小變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，如測試條件要求苛刻時則應在方法中注明；⑥靈敏度：作為常量分析法，此項可不作主要要求。,UV法的驗證：①精密度：RSD≤1%（n＝5）；②準確度：方法同HPLC法，回收率應在98%～102%之間（n＝9, RSD≤2%），同時要求輔料、有關物質(zhì)或降解產(chǎn)物在測定波長處無吸收。③線性范圍：用已知含量的精制品配制一系列濃度的溶液