SfaMNPV誘導(dǎo)的SL-1細胞凋亡及EndoG的檢測.pdf

1、本實驗采用SfaMNPV誘導(dǎo)的SL-1細胞的凋亡，研究了SL-1細胞凋亡的特征，檢測了SL-1細胞中是否存在核酸內(nèi)切酶G(EndonucleaseG)，初步探究了昆蟲細胞中是否存在起源于線粒體的非caspase依賴性的凋亡途徑。主要結(jié)果如下： (1)SfaMNPV誘導(dǎo)SL-1細胞出現(xiàn)了典型的凋亡特征SfaMNPV能在Tn-581細胞中有效增值，測得病毒滴度為2.41X10<'7>pfu/ml。SfaMNPV誘導(dǎo)SL-1細胞產(chǎn)生了

2、典型細胞凋亡特征。病毒處理細胞8-16h在光鏡下可見細胞膜表面突出或形成小泡，細胞形成了大量的凋亡小體；24h后，細胞幾乎全部破裂成凋亡小體。DAPI熒光染色顯示感染細胞核逐漸變形，直至破裂成小塊而被凋亡小體包裹。凋亡細胞DNA瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)典型凋亡細胞DNA梯形電泳譜帶，且誘導(dǎo)時間越長，梯型條帶越明顯。用流式細胞儀對線粒體膜電位(△Ψm)進行檢測，結(jié)果表明，細胞經(jīng)羅丹明(Rho-123)染色后在流式細胞儀上檢測，處理2小時后即出現(xiàn)

3、熒光強度下降，說明膜電位下降是細胞凋亡的早期事件，細胞凋亡過程中線粒體膜電位下降且呈時間依賴性。 (2)EndoG可能不存在于SL-1細胞中對哺乳動物細胞凋亡研究表明：EndoG屬于Mg<'2+>依賴性DNA/RNA非特異性核酸酶重要家族，由核基因編碼，在細胞質(zhì)中翻譯成前體蛋白，隨后轉(zhuǎn)運至線粒體中切割掉其N端48個氨基酸變?yōu)槌墒祗w．它是線粒體特異性核酸酶，在凋亡刺激下，一旦EndoG從線粒體膜間隙釋放，能夠切割細胞核染色質(zhì)DNA

4、,產(chǎn)生以核小體DNA長度為基數(shù)的DNA片段，這一過程是不依賴caspase活化的。 采甩western blotting檢測SfaMNPV誘導(dǎo)SL-1細胞凋亡后，是否存在EndoG的釋放，以及它在SL-1細胞線粒體和細胞質(zhì)中的變化情況。實驗結(jié)果顯示在凋亡的SL-1細胞的細胞質(zhì)及線粒體組分中均未檢測到EndoG。由此表明在SfaMNPV誘導(dǎo)SL-1細胞凋亡中可能不存在EndoG從線粒體釋放到細胞質(zhì)中并最終作用細胞DNA的事件，提示