中藥血清藥理學(xué)及其在腫瘤藥理中的應(yīng)用

1、1,中藥血清藥理學(xué),在腫瘤藥理中的應(yīng)用,及其,2,,1概說2血清供體動(dòng)物的選擇3動(dòng)物給藥及采血方案的設(shè)計(jì)4血清的滅活5血清的添加,6含藥血清的保存7實(shí)驗(yàn)研究舉例 8血清藥理學(xué)研究中存在的問題9血清藥理學(xué)工作的發(fā)展趨勢(shì),3,1概說,中藥血清藥理實(shí)驗(yàn)方法是一種新的改良的中藥體外實(shí)驗(yàn)方法。它將受試物（試驗(yàn)樣品）經(jīng)口給與動(dòng)物后，取其血清作為藥物源加入離體實(shí)驗(yàn)體系中研究其藥理作用。,4,關(guān)于血清藥理學(xué)的幾篇重要的文獻(xiàn)：,[Iwama

2、 H，Effcet of Shosaikoto（復(fù)方小柴胡湯），a Japanese and Chinese Triditional herbal medicinal mixture on the mitogenic activity of lipopolysaccharide，A new pharmacology testing method， J Ethnopharmacol，1987，211：45]，[田代真一，“血清藥理學(xué)”

3、と“血清藥化學(xué)”——漢方の藥理學(xué)から始まつた藥物血中濃度測(cè)定の新しい世界，TDM研究，1988，（5）：54][張群豪、陳可冀：血清藥理學(xué)在中藥及復(fù)方研究中應(yīng)用的評(píng)價(jià)，中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1996，16（3）：131 [張群豪、鐘蓓、陳可冀，等：用血清藥理學(xué)方法觀察血府逐瘀濃縮丸對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化家兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響，中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1996，16（3）：156,5,中藥血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)操作基本過程：,,,,,分離血清

4、（滅活？）,保存（條件？時(shí)間？）,,6,2血清供體動(dòng)物的選擇,2.1動(dòng)物的種屬實(shí)驗(yàn)證實(shí)動(dòng)物血清具有細(xì)胞毒作用，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，這種細(xì)胞毒性作用似與種屬親緣有關(guān)，與實(shí)驗(yàn)體系中細(xì)胞親緣關(guān)系最接近的動(dòng)物血清細(xì)胞毒性作用最輕，而親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的動(dòng)物血清，較高濃度時(shí)就會(huì)影響細(xì)胞的生存。,7,附表1 異種血清的細(xì)胞毒作用,與10%小牛血清組比較，a p＜0.05， b p＜0.01。細(xì)胞毒性大小排隊(duì)（由小到大）：大鼠＜家兔＜豚鼠≈犬＜小牛

5、＜人。,8,上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在生物分類中的位置：,哺乳綱（Mamalia）真獸亞綱（Eutheria）嚙齒目（Rodentia）： 鼠科（Muridae） 小鼠：小鼠屬（Mus）小家鼠（M.musculus）變種（M.n.albula）大鼠：大鼠屬（Rattus）褐家鼠（R.norregicus）變種（R.n.albus） 豚鼠科（Caviidae） 豚鼠：豚鼠屬（Cavia）豚鼠（C. porcellus）兔

6、形目（Lagomorpha）（最初分類歸于嚙齒目） 兔科（Lepus） 家兔：真兔屬（Oryctolagus）兔（O. cuniculus）,9,上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在生物分類中的位置：,食肉目（Carnivora） 犬科（Canidae）犬：犬屬（Canis）家犬（C. familiaris）偶蹄目（Artiodactyla） ?？疲˙ovidae）牛：牛屬（Bos）黃牛（Bos Taurus domesticu

7、s Gmelin） 水牛屬（Bubalus）水牛（Bubalus bubalis Linnaeus）靈長目（Primates） 人科（Hominidae）人：人屬（Homo）智人（H. sapiens）中藥腫瘤血清藥理學(xué)研究中所用動(dòng)物主要為小鼠、大鼠以及家兔,10,2血清供體動(dòng)物的選擇,2.2動(dòng)物的狀態(tài)依據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況供體動(dòng)物可以選擇生理狀態(tài)下的動(dòng)物，也可以選擇病理狀態(tài)（疾病模型）下的動(dòng)物。中藥腫瘤血清藥

8、理學(xué)研究中所用血清供體動(dòng)物，主要選擇正常生理狀態(tài)下的動(dòng)物，但亦有選擇荷瘤動(dòng)物作為供體動(dòng)物的。,11,3動(dòng)物給藥及采血方案的設(shè)計(jì),3.1給藥劑量與次數(shù)A已知臨床用藥劑量給藥劑量=臨床人用劑量×動(dòng)物等效劑量系數(shù)×在體外實(shí)驗(yàn)體系內(nèi)的稀釋度。B已知?jiǎng)游锼幮W(xué)實(shí)驗(yàn)的有效劑量給藥劑量=動(dòng)物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)有效劑量×動(dòng)物等效劑量換算系數(shù)（更換動(dòng)物時(shí)）×在體外實(shí)驗(yàn)體系內(nèi)的稀釋度。,12,3動(dòng)物給藥及采血方案的設(shè)

9、計(jì),例如某中藥臨床人用劑量為10g/日，體重按50kg計(jì)算，則臨床人用為0.2g/kg；血清供體動(dòng)物選擇大鼠，其等效劑量系數(shù)粗略的按照5來計(jì)算，在體外實(shí)驗(yàn)體系中添加含藥血清的量按照20%進(jìn)行（稀釋倍數(shù)為5），代入上式計(jì)算得到：供體動(dòng)物給藥劑量=0.2×5×5=5g/kg,13,3動(dòng)物給藥及采血方案的設(shè)計(jì),3.2給藥次數(shù)在大多數(shù)情況下，多次給藥優(yōu)于單次給藥。多次給藥優(yōu)于單次給藥具有一定的理論依據(jù)，它的理論取決于以

10、下兩個(gè)因素：其一、是藥物有無蓄積作用，文獻(xiàn)資料表明，大多數(shù)藥物具有一定的蓄積性的；其二、是多次給藥后，是否會(huì)在藥物的作用下機(jī)體產(chǎn)生自體活性物質(zhì)，比如激素或免疫活性物質(zhì)，以及這些活性物質(zhì)在該藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)中作用的大小。,14,3動(dòng)物給藥及采血方案的設(shè)計(jì),給藥次數(shù)大多為每日1次，連續(xù)3至7天，但也可以參照血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)通法，每日給藥2次（間隔12小時(shí)），連續(xù)給藥3天。另外，需要注意的是為了便于藥物吸收，有人主張采血前的最后一次給藥動(dòng)物應(yīng)予

11、以禁食，禁食時(shí)間一般認(rèn)為以12 ~ 16小時(shí)為宜。,15,3動(dòng)物給藥及采血方案的設(shè)計(jì),3.3采血時(shí)間與方法3.3.1采血時(shí)間的確定在實(shí)際操作中，采血時(shí)間大多在給藥后1至2小時(shí)，也有縮短至0.5小時(shí)或延長至4小時(shí)的。3.3.2采血要求：①采血必須在嚴(yán)格無菌的條件下進(jìn)行。②如果采用麻醉的話，建議采用乙醚吸入麻醉。③靜置2小時(shí)以上，保證血液徹底凝固，得到真正的“血清”。④離心（3000rpm）10至15分鐘，得到含藥血清。⑤必要時(shí)，可以

12、用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。,16,3動(dòng)物給藥及采血方案的設(shè)計(jì),3.4關(guān)于中藥血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)通法資料：文獻(xiàn)載有口服給藥Tmax（血藥高峰時(shí)間）的藥物113個(gè)，文獻(xiàn)載有T1/2（半衰期）的藥物412個(gè)?；A(chǔ)理論依據(jù)：（1）藥物多次給藥后，經(jīng)過4~5個(gè)T1/2達(dá)到坪值，此后停止給藥，按一級(jí)動(dòng)力學(xué)清除的藥物也要經(jīng)過4~5個(gè)T1/2在體內(nèi)基本消除，對(duì)少數(shù)按照零級(jí)動(dòng)力學(xué)（按每單位時(shí)間消除恒定藥量使血漿濃度逐漸下降）消除的藥物則需要更長時(shí)間

13、。（2）在一次給藥后，藥物尚未達(dá)到完全消除而接受第二次給藥，血藥濃度可因蓄積而積累。,17,3動(dòng)物給藥及采血方案的設(shè)計(jì),采血時(shí)間點(diǎn)確定：將已知口服給藥Tmax數(shù)據(jù)的113個(gè)藥物進(jìn)行頻譜分析如下：附表3-1 Tmax的分布范圍是15min ~ 24h，符合正態(tài)分布，排列數(shù)據(jù)時(shí)0.5 ~ 1h按0.5h計(jì)算，1 ~ 2h按1h計(jì)算。Tmax在1h的有49個(gè)藥物，占43.4%（49/113），若加上30min ~1h的10個(gè)藥，則比

14、例高達(dá)52.2%（59/113），也就是說，口服藥物后1h血中藥物達(dá)到高峰濃度（Cmax）的機(jī)會(huì)（概率）是52.2%。,18,藥物蓄積性分析：依據(jù)藥動(dòng)學(xué)理論，一種藥物能否蓄積，取決于該藥T1/2的長短和服藥時(shí)間間隔。如果藥物尚未完全消除而第二次給藥，即可產(chǎn)生蓄積。412個(gè)已知T1/2的藥品頻譜分析如下：,附表3-2,T1/2分布范圍是12min ~ 150h，符合正態(tài)分布，T1/2＞3h的藥物有216個(gè)，占67%（216/412）。若每

15、日給藥2次，間隔12h，那么T1/2＞3h的藥物均可產(chǎn)生蓄積。,19,3動(dòng)物給藥及采血方案的設(shè)計(jì),依據(jù)上述推論得到實(shí)驗(yàn)通法。通法規(guī)定，口服給藥，每日2次，間隔12h，連續(xù)給藥3天，末次給藥后1h采血，總體而言中藥成分中約67%可能具有蓄積作用，再加上無蓄積性但在其口服后1h在Tmax內(nèi)的68個(gè)藥品，占412個(gè)藥品中的16.5%，兩者相加可達(dá)83.5%。,20,附表3-3 例：一項(xiàng)關(guān)于含藥血清藥理作用強(qiáng)度與體內(nèi)給藥的量效、時(shí)效關(guān)系研究

16、的結(jié)果,注：與空白血清組比較，a p＜0.05， b p＜0.001。 n（每組復(fù)空數(shù)）=8，含藥血清加入量10%。實(shí)驗(yàn)方法：大鼠灌胃給以待測(cè)樣品，劑量為45、90、180、360mg/kg，1/d，5d，末次給藥后30、60、90、120分鐘采血，制備含藥血清，作用于缺氧復(fù)氧損傷的乳鼠心肌細(xì)胞，通過測(cè)定LDH釋放量及其抑制率來評(píng)價(jià)藥物血清對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用。,21,4血清的滅活,4.1血清滅活的原因與目的附表4-1滅活與非滅活

17、正常（空白）血清對(duì)細(xì)胞生長的影響 與非滅活血清比較a p＜0.05， b p＜0.01血清來源：大鼠；細(xì)胞系：小鼠3T3細(xì)胞株。,22,4血清的滅活,附表4-2滅活與否對(duì)含藥血清生物活性的影響（一）某藥物含藥血清對(duì)病毒致細(xì)胞病變作用的影響 血清來源：家兔細(xì)胞系：Hep-2人喉癌細(xì)胞株病毒：副流感病毒-Ⅱ型,23,附表4-3,滅活與否對(duì)含藥血清生物活性的影響（二）某藥物含藥血清對(duì)小鼠離體子

18、宮收縮的影響,空白血清各組均與未處理組比較 a p＜0.05， b p＜0.01采用同一處理方法空白血清組與含藥血清組比較 ▲p＜0.01。血清來源： 小鼠,24,4血清的滅活,4.2血清滅活的方法①加熱滅活法：加熱56℃，維持30分鐘。（最常用的方法）②丙酮滅活法：在血清中加入4至5倍量的丙酮，混勻，3000rpm離心，取上清液水浴，揮干丙酮即可。③乙醇滅活法：處置方法同丙酮滅活法。將丙酮更換成乙醇即可。,25,5血清

19、的添加,決定藥物血清添加量多少主要取決于以下兩點(diǎn)：①血清本身具有生物活性，其中包括細(xì)胞毒活性。②中藥成分的復(fù)雜性決定了藥血清藥理學(xué)量效關(guān)系往往不明確。,26,附表5 不同血清添加量對(duì)細(xì)胞（3T3）生長的影響,另外，含藥血清也可以制備成凍干粉直接加入實(shí)驗(yàn)體系中。對(duì)于抗腫瘤中藥血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)而言，含藥血清的添加量一般多為10% ~ 20%。,27,6含藥血清的保存,在4℃環(huán)境下，一般不宜超過5天，低溫條件下，可以適當(dāng)延長保存時(shí)間。,

20、28,7實(shí)驗(yàn)研究舉例,29,例1,【樣 品】中藥腸安泰（組方：大黃 藤梨根 薏苡仁 木香等8味）【研究目的】觀察腸安泰及其主要成分藥物（大黃、藤梨根）的含藥血清對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力?！灸[瘤細(xì)胞】Co26lu大腸癌細(xì)胞株【動(dòng) 物】Wistar大鼠，♀，300±10g。,30,例1,【給藥方案】腸安泰（干膏）、大黃（干膏）、藤梨根（干膏），ig，0.6ml·kg-1·d-1。劑量分別為腸

21、安泰0.8g·kg-1（相當(dāng)于人用劑量的8倍），大黃0.8g·kg-1，藤梨根0.8g·kg-1。兩種方案， 一日給藥和三日給藥，前者給藥一次，1小時(shí)后采血，后者連續(xù)給藥三日，每日一次，末次給藥后1小時(shí)采血。給藥前均禁食6 ~ 12小時(shí)。,31,例1,【血清處置】56℃，30分鐘滅活，-20℃保存?zhèn)溆谩?【試驗(yàn)體系】腫瘤細(xì)胞1×106個(gè)/ml，加入96孔板，90μl/孔?！狙寮恿俊?0%、3

22、0%、50%?！驹u(píng)價(jià)方法】MTT法,32,例1,【評(píng)價(jià)指標(biāo)】OD值、腫瘤生長抑制率。 【實(shí)驗(yàn)過程】動(dòng)物給藥， 采血， 分離血清， 加入試驗(yàn)體系， 37℃，5%CO2培養(yǎng)24小時(shí)， 加入MTT，4小時(shí)， 比色， 測(cè)定OD值， 計(jì)算腫瘤生長抑制率?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】詳見附表,33,例1實(shí)驗(yàn)結(jié)果附表,與模型組相比，※P＜0.05，※※P＜0.01。,34,例1,【實(shí)驗(yàn)結(jié)論】腸安泰具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，并呈劑量依賴性，且復(fù)方的抗腫瘤活性優(yōu)

23、于單味藥。王文萍，等：中藥腸安泰體外對(duì)Co26lu大腸癌細(xì)胞的血清藥理學(xué)研究，中華中醫(yī)藥研究，2006，21（4）：213,35,例2,【樣 品】參葵湯（苦參 龍葵 山慈菇 墓頭回 莪術(shù) 黃芪 女貞子 當(dāng)歸 甘草等12味）【研究目的】研究參葵湯對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響【腫瘤細(xì)胞】Tyk-nu卵巢癌細(xì)胞株，人新鮮的卵巢癌組織分離細(xì)胞。【動(dòng) 物】SD大鼠，♂，300±10g。,36,例2,【給藥方

24、案】灌胃給藥，3.27、6.54、13.08g / 300g（等于10.9、21.8、43.6g / kg，相當(dāng)于臨床人用的等效劑量、2及4倍等效劑量），每日1次， 連續(xù)10日， 末次給藥后1小時(shí)采血 【血清處置】56℃，30分鐘滅活。,37,例2,【實(shí)驗(yàn)體系】腫瘤細(xì)胞5×105個(gè)/ml，加入96孔板，190μl/孔，3復(fù)孔?！狙寮恿俊?0%，配置培養(yǎng)基時(shí)加入。【評(píng)價(jià)方法】3H-TdR摻入法、流式細(xì)胞術(shù)、胎盤蘭染色計(jì)數(shù)

25、、細(xì)胞集落形成?！驹u(píng)價(jià)指標(biāo)】同位素放射脈沖量（cpm）、細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）、細(xì)胞活力、集落形成率、,38,例2,【實(shí)驗(yàn)過程】動(dòng)物給藥， 采血， 分離血清， 加入培養(yǎng)基中，分離腫瘤組織，制備新鮮及傳代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的懸液，37℃，5%CO2，100%濕度，分別培養(yǎng)60、72、48、72小時(shí)供cpm、PI、細(xì)胞活力、集落形成率等測(cè)定?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】詳見附表,39,例2實(shí)驗(yàn)結(jié)果附表,（一）含藥血清對(duì)新鮮卵巢癌腫瘤組織細(xì)胞增殖的影響,※與空

26、白血清組比較P＜0.01；＃與低濃度含藥血清組比較P＜0.01；○與中濃度含藥血清組比較P＜0.05。,40,（二）藥血清對(duì)Tyk-nu卵巢癌細(xì)胞增殖的影響,與空白血清組比較※P＜0.05；與低濃度含藥血清組比較＃ P＜0.01；與中濃度含藥血清組比較○ P＜0.05 P＜0.05,41,例2,【實(shí)驗(yàn)結(jié)論】含參葵湯大鼠血清可抑制卵巢癌新鮮實(shí)體瘤細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞株Tyk-nu細(xì)胞增殖。 張軍，等：參葵湯對(duì)卵巢癌患者新鮮實(shí)體瘤細(xì)胞

27、及細(xì)胞株Tyk-nu細(xì)胞增殖的影響，中醫(yī)雜志， 2005，46（3）：219,42,例3,【樣 品】三物白散加味方（含10%油的巴豆霜 貝母 桔梗 地鱉蟲 莪術(shù) 參三七 生薏苡仁 全蝎 木香 炒白芍藥 甘草等）（注：三物白散方 自《傷寒論》【研究目的】在臨床治療胃癌有效的基礎(chǔ)上， 觀察藥物對(duì)胃癌細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的影響【腫瘤細(xì)胞】胃癌SGC-7901細(xì)胞株?！緞?dòng) 物】日本大耳白，2.5±

28、0.2kg，♀/♂，每劑量組2只。,43,例3,【給藥方案】灌胃給藥，0.21、0.63、2.1g/只，1次/日，連續(xù)3日，末次給藥后2小時(shí)， 心臟采血， 分離血清。 【血清處置】56℃，30分鐘滅活，0.22μm微孔過濾除菌， -20℃保存。 【實(shí)驗(yàn)體系】腫瘤細(xì)胞數(shù)量無記載?！狙寮恿俊?00%。 （？）【評(píng)價(jià)方法】單抗試劑盒， 流式細(xì)胞術(shù)【評(píng)價(jià)指標(biāo)】多藥耐藥基因MDR,44,例3,【實(shí)驗(yàn)過程】胃癌SGC-7901細(xì)胞株傳

29、代培養(yǎng)， 胰酶消化，分瓶，待細(xì)胞貼壁后加入三個(gè)劑量組的血清，作用10小時(shí)， 免疫標(biāo)記，流式細(xì)胞儀測(cè)試?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】三物白散加味方含藥血清對(duì)胃癌腫瘤細(xì)胞多藥耐藥基因表達(dá)具有抑制作用，并呈量效關(guān)系。,45,三物白散加味方對(duì)MDR基因表達(dá)率的影響,※※與陰性對(duì)照組相比P＜0.01。,例3實(shí)驗(yàn)結(jié)果附表,46,例3,【實(shí)驗(yàn)結(jié)論】三物白散加味方對(duì)胃癌腫瘤細(xì)胞多藥耐藥基因表達(dá)有抑制作用。[徐力，等：三物白散加味方影響多藥耐藥基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)研究，上海

30、中醫(yī)藥雜志，2005，39（8）：59],47,例4,【樣 品】黃連解毒湯（黃連 黃芩 黃柏 梔子組成）【研究目的】評(píng)價(jià)黃連解毒湯的抗腫瘤活性。【腫瘤細(xì)胞】結(jié)腸癌Swille、肺腺癌SPC-A-1、胃癌SGC-7901、乳腺癌MCF-7細(xì)胞株?！緞?dòng) 物】荷瘤（H22肝癌）小鼠，昆明種，18 ~ 22g，♀，每組11 ~ 12只。,48,例4,【給藥方案】灌胃給藥， 黃連解毒湯49.5、16.5、5.5g/kg（相

31、當(dāng)于臨床人用劑量的9、3、1倍），1次/日，連續(xù)8日，末次給藥后1小時(shí)摘眼球取血，分離并合并動(dòng)物血清。同期給以陽性對(duì)照藥環(huán)磷酰胺，25mg/kg?！狙逄幹谩浚ú粶缁睿?，0.22μm微孔過濾除菌， -20℃保存?！緦?shí)驗(yàn)體系】4種腫瘤細(xì)胞配置濃度均為1×105個(gè)/ ml，接種于96孔板，每孔100μl，每組10復(fù)孔。【血清加量】20%。【評(píng)價(jià)方法】MTT法?！驹u(píng)價(jià)指標(biāo)】細(xì)胞生長抑制率。,49,例4,【實(shí)驗(yàn)過程】動(dòng)物接種

32、腫瘤細(xì)胞，分組，給藥，給藥結(jié)束，采血，分離合并血清，結(jié)腸癌Swille等腫瘤細(xì)胞體系中加入含藥血清，培養(yǎng)72小時(shí)，加入MTT，培養(yǎng)4小時(shí)，比色， 測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。 【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】詳見附表。黃連解毒湯對(duì)H22小鼠肝癌實(shí)體瘤有一定的體內(nèi)抗腫瘤活性，并具劑量依賴性；其含藥血清體外對(duì)4種人的腫瘤細(xì)胞也有一定的抑制作用?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)論】黃連解毒湯體內(nèi)、體外均有抗腫瘤活性，結(jié)果具有一致性且呈明確的量效關(guān)系。[孫健，等：黃連解毒湯抗腫

33、瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究，中國中藥雜志，2006，31（17）：1461],50,例4實(shí)驗(yàn)結(jié)果附表黃連解毒湯20%含藥血清體內(nèi)、外腫瘤抑制作用,與對(duì)照組相比， 2）P＜0.01，3）P＜0.001。,51,例5,【樣 品】黃連解毒湯（黃連 黃芩 黃柏 梔子組成）【研究目的】對(duì)比黃連解毒湯及其含藥血清的抗腫瘤作用，進(jìn)行化學(xué)成分分析?！灸[瘤細(xì)胞】肺癌NCI-H446、肝癌Bel-7402細(xì)胞株。【動(dòng) 物】Wistar大鼠

34、，♂，250 ~ 300g，8只/組。【給藥方案】灌胃給藥， 黃連解毒湯21、10.5、5.25g/kg，2次/日，連續(xù)3日，末次給藥（灌藥前禁食16小時(shí)）后2小時(shí)，乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈采血，無菌分離血清，同組血清合并?！狙逄幹谩?6℃，30分鐘滅活，0.22μm微孔濾膜過濾除菌， -20℃保存。,52,例5,【實(shí)驗(yàn)體系】兩種細(xì)胞懸液濃度均為2.5×104個(gè)/ml，接種于96孔板，每孔100μl，每組6復(fù)孔。【血清加量】

35、20%?！驹u(píng)價(jià)方法】MTT法?！驹u(píng)價(jià)指標(biāo)】細(xì)胞生長抑制率?！緦?shí)驗(yàn)過程】在觀察黃連解毒湯含藥血清對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的同時(shí)， 同步觀察黃連解毒湯樣品對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的影響。 采用 HPLC梯度洗脫對(duì)比分析了黃連解毒湯及其含藥血清化學(xué)成分的異同。,53,例5,【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】黃連解毒湯及其含藥血清對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的影響詳見附表。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們對(duì)2株腫瘤細(xì)胞的生長均有抑制作用，HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示， 黃連解毒湯含藥血清與空白血清對(duì)比發(fā)現(xiàn)，口服黃連解毒

36、湯的吸收入學(xué)的成分較多，經(jīng)過黃連解毒湯樣品與其含藥血清進(jìn)行對(duì)比分析，初步確定了10個(gè)來源于復(fù)方的原型成分，同時(shí)還有幾個(gè)代謝產(chǎn)物，但原方劑中的主要成分并未在血清中檢測(cè)到。,54,例5實(shí)驗(yàn)結(jié)果附表黃連解毒湯的腫瘤生長抑制作用,與0劑量組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01，3）P＜0.001,55,20%黃連解毒湯含藥血清的腫瘤生長抑制作用,與空白血清組比較：1）P＜0.01，2）P＜0.001。,56,例5,【實(shí)驗(yàn)結(jié)論】黃連解毒湯及

37、其含藥血清對(duì)2種瘤株抑制程度變化的原因可能是黃連解毒湯中各主要成分吸收入血后含量變化造成的。對(duì)其進(jìn)行深入研究，將有助于闡明黃連解毒湯抗腫瘤的有效成分及作用機(jī)制。[孫健，等：黃連解毒湯及其含藥血清的化學(xué)成分及抗腫瘤作用對(duì)比研究，中國中藥雜志，2006，31（18）：1526],57,例6,【樣 品】復(fù)方斑蝥膠囊（國藥準(zhǔn)字Z19993409）。【研究目的】考察該藥含藥血清對(duì)肝癌腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)組的影響，從分子水平探討其抗腫瘤的作用機(jī)

38、制?！灸[瘤細(xì)胞】肝癌SMMC-7721細(xì)胞株?！緞?dòng) 物】新西蘭大耳白兔，2.5±0.2kg，♀/♂兼用。,58,例6,【給藥方案】按下述公式計(jì)算動(dòng)物給藥劑量：動(dòng)物給藥劑量=臨床用量×等效劑量系數(shù)×培養(yǎng)體系血清稀釋度式中：等效劑量系數(shù)（按體表面積計(jì)算）=S兔/S人lgS = 0.8762 + 0.698 lgW（動(dòng)物 體表面積和體重之間的關(guān)系式）S = 體表面積（cm2）W = 體重（g）

39、計(jì)算得到家兔給藥劑量為3倍臨床等效劑量。以PBS將復(fù)方斑蝥膠囊配置成混懸液，連續(xù)灌胃3日，末次給藥后3小時(shí)心臟采血，收集血清，同組血清合并。,59,例6,【血清處置】56℃，30分鐘滅活，0.22μm微孔過濾除菌， -20℃保存?！緦?shí)驗(yàn)體系】（略）【血清加量】10%?！驹u(píng)價(jià)方法】雙向電泳，圖像分析，質(zhì)譜鑒定?！驹u(píng)價(jià)指標(biāo)】含藥血清作用后差異蛋白的表達(dá)情況及質(zhì)譜鑒定?！緦?shí)驗(yàn)過程】含藥血清作用于腫瘤細(xì)胞72小時(shí)，分離，清洗，收集細(xì)

40、胞；細(xì)胞裂解，提取蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)雙向電泳，染色，圖像分析，選取具有2倍以上量變的蛋白質(zhì)（差異蛋白質(zhì)）；質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定蛋白質(zhì)點(diǎn)。,60,例6,【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】結(jié)果詳見附表。【實(shí)驗(yàn)結(jié)論】發(fā)現(xiàn)4種與腫瘤的增殖、免疫、凋亡相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步研究藥物作用機(jī)制提供了線索。血清藥理學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合能夠有效的展示與藥物作用相關(guān)蛋白質(zhì)，可以作為研究復(fù)方藥理的一個(gè)初步技術(shù)平臺(tái)。[曹永艷，等：復(fù)方斑蝥膠囊血清誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7

41、721細(xì)胞蛋白質(zhì)組差異表達(dá)分析，中國中藥雜志，2007，32（9）：831],61,例6實(shí)驗(yàn)結(jié)果附表質(zhì)譜鑒定的差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn),真核翻譯起始因子5A（eIF-5A）：表達(dá)下調(diào)?？鼓[瘤作用的重要靶標(biāo)，在低分化、12/13密碼子K-ras突變、p53核蓄積的腫瘤中高表達(dá)。膜聯(lián)蛋白A5（Annexin Ⅴ）：表達(dá)上調(diào)。一種抗腫瘤增殖的蛋白質(zhì)。熱休克70×103蛋白（HSP70）：表達(dá)上調(diào)。與腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)。硫氧還蛋

42、白過氧化酶（PRDX2）2：表達(dá)下調(diào)。一種作用于Bcl-2上游的抗凋亡蛋白。,62,例7,【樣 品】多羅清泰顆粒（女貞子 黃芪 靈芝 蒲公英 紅景天 藏紅花 半支蓮 蛇舌草 茯苓 葛根等組成）【研究目的】在證實(shí)多羅清泰顆粒體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠肝癌有抑制作用的基礎(chǔ)上，以血清藥理學(xué)方法和基因芯片技術(shù)觀察藥物對(duì)人肝癌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)的影響。【腫瘤細(xì)胞】肝癌SMMC-7721細(xì)胞株?！緞?dòng) 物】SD大鼠，300&

43、#177;30g，♂，30只，隨機(jī)分為3組?！窘o藥方案】灌胃給藥，8、16g/kg（相當(dāng)于生物等效劑量的4倍和8倍），1次/日，連續(xù)10日，末次給藥前禁食12小時(shí)，給藥后1小時(shí)摘眼球取血，無菌分離血清。,63,例7,【血清處置】56℃，30分鐘滅活，0.22μm微孔濾膜過濾除菌， -20℃保存?！緦?shí)驗(yàn)體系】肝癌SMMC-7721細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)?！狙寮恿俊?0%?！驹u(píng)價(jià)方法】基因芯片技術(shù)?！驹u(píng)價(jià)指標(biāo)】基因轉(zhuǎn)錄相對(duì)豐度分析。【

44、實(shí)驗(yàn)過程】含藥血清與腫瘤細(xì)胞共同培育48小時(shí)， 收集，清洗，裂解細(xì)胞；提取并鑒定DNA，制備探針，雜交，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析；RT-PCR驗(yàn)證基因芯片檢測(cè)結(jié)果。,64,例7,【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】多羅清泰顆粒含藥血清對(duì)所檢測(cè)的99條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因中的68條基因表達(dá)具有顯著影響，占所測(cè)基因的69%，其中，上調(diào)基因?yàn)?6條，下調(diào)基因?yàn)?6條，不同劑量組之間的基因表達(dá)存在相當(dāng)大的差異?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)論】多羅清泰顆粒能顯著抑制肝癌細(xì)胞的生長，能顯著影響肝癌細(xì)

45、胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)。[謝佐福，等：多羅清泰顆粒對(duì)人肝癌細(xì)胞株信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)的影響，中草藥，2007，38（5）：720],65,例8,【樣 品】半夏瀉心方全方（半夏 干姜 黃芩 黃連 人參 大棗 甘草組成）以及6個(gè)不同的配伍方（辛開 苦降 辛苦 甘補(bǔ) 辛甘 苦甘組方）。【研究目的】研究半夏瀉心方全方及不同配伍方含藥血清對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制?！灸[瘤細(xì)胞】胃癌BGC-823細(xì)胞株【動(dòng)

46、物】家兔，2.0 ~ 2.5kg，2只/組?！窘o藥方案】全方及6種配伍方給藥劑量分別為52、20.8、10.4、31.2、20.8、39、31.2g/kg（相當(dāng)于臨床人用劑量的10倍）。 連續(xù)灌胃3次， 第1、2次間隔20小時(shí)， 第2、3次間隔4小時(shí)，實(shí)驗(yàn)前禁食12小時(shí)。末次給藥后2小時(shí)無菌條件下心臟采血， 分離血清。,66,例8,【血清處置】56℃，30分鐘滅活， -20℃保存。經(jīng)培養(yǎng)證實(shí)沒有微生物生長?！緦?shí)驗(yàn)體系】傳代培養(yǎng)胃癌B

47、GC-823細(xì)胞，以培養(yǎng)液懸浮成細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，每濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔?！狙寮恿俊?%和10%?！驹u(píng)價(jià)方法】MTT法（細(xì)胞毒作用評(píng)價(jià)）、DNA凝膠電泳（細(xì)胞凋亡檢測(cè)）、S-P免疫組化法（Bcl-2基因表達(dá)）?！驹u(píng)價(jià)指標(biāo)】細(xì)胞存活率，DNA“梯狀帶”顯示，基因表達(dá)陽性細(xì)胞率。,67,例8,【實(shí)驗(yàn)過程】①將含藥血清加入到對(duì)數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)體系中，分別培育24、48、72小時(shí)，爾后，以MTT法

48、測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。②取以含藥血清作用48小時(shí)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳。③將細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液加入到直徑為5厘米的培養(yǎng)皿中，并在皿中放置小塊玻片先培養(yǎng)24小時(shí)，加入含藥血清，孵育48小時(shí)，取出玻片，清洗，固定，干燥，免疫組化染色。,68,例8,【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】樣品全方及不同配伍方對(duì)細(xì)胞生長的影響結(jié)果詳見附表。DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，全方、甘補(bǔ)、辛甘、苦甘組含藥血清在凝膠電泳中未能見

49、到典型的“梯狀帶”。辛苦、辛開、苦降組10%含藥血清作用的細(xì)胞，其凝膠電泳中可見典型的“梯狀帶”。免疫組化結(jié)果顯示，未經(jīng)處理腫瘤細(xì)胞的Bcl-2基因產(chǎn)物高表達(dá)，在樣品全方及不同配伍方含藥血清的作用下，Bcl-2的表達(dá)受到程度不等的抑制，其中辛苦、辛開、苦降組作用明顯，并以辛苦組作用最佳。,69,例8,【實(shí)驗(yàn)結(jié)論】半夏瀉心方中辛開、苦降的配伍形式具有抑制BGC-823細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，辛開、苦降配伍后（辛苦）有顯著協(xié)同增效趨勢(shì)，

50、而其他配伍藥群可能存在拮抗作用。提示辛開苦降法可能是中醫(yī)藥防治胃癌的主要治則治法之一。[劉喜平，等：半夏瀉心方配伍與誘導(dǎo)BGC-823 細(xì)胞凋亡關(guān)系血清藥理學(xué)研究，中醫(yī)雜志，2006，47（2）：134],70,例8實(shí)驗(yàn)結(jié)果附表 半夏瀉心方及配伍藥組含藥血清對(duì)BGC-823細(xì)胞生長的影響,與空白組同項(xiàng)目比較，※P＜0.05，※※P＜0.01；與辛苦組同項(xiàng)目比較，△P＜0.05；與苦降組同項(xiàng)目比較，▲P＜0.05；

51、與辛開組同項(xiàng)目比較，▽P＜0.05。,71,例9,【樣 品】川芎嗪【研究目的】觀察川芎嗪含藥血清對(duì)人肝癌細(xì)胞Hep G2增殖的影響?！灸[瘤細(xì)胞】肝癌Hep G2細(xì)胞株?！緞?dòng) 物】SD大鼠，♂，250 ~ 300g，10只/組?！窘o藥方案】川芎嗪143.0、71.5mg/kg，腹腔注射，1次/日，連續(xù)7日，末次給藥后0.5小時(shí)于無菌條件下經(jīng)股動(dòng)脈采血，分離血清，同組合并?！狙逄幹谩?.45μm微孔濾膜過濾除菌， 分

52、裝，-20℃保存?！緦?shí)驗(yàn)體系】以1×104個(gè)/ml濃度的Hep G2腫瘤細(xì)胞懸液接種于96孔板，200μl/孔，每組6復(fù)孔。,72,例9,【血清加量】20%、10%、5%?！驹u(píng)價(jià)方法】MTT法，RP-HPLC法?！驹u(píng)價(jià)指標(biāo)】腫瘤細(xì)胞生長抑制率，含藥血清中川芎嗪的含量?！緦?shí)驗(yàn)過程】在經(jīng)過24小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)的96孔板中加入濃度不等的含藥血清及空白對(duì)照血清，孵育48小時(shí)， MTT法測(cè)定每孔的吸光度，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。另一部分

53、高劑量組含藥血清將被用來測(cè)定川芎嗪的含量?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】含藥血清對(duì)腫瘤細(xì)胞生長抑制作用的結(jié)果詳見附表。川芎嗪含量測(cè)定表明，高劑量組大鼠含藥血清中其含量為381.5μg/ml。,73,例9實(shí)驗(yàn)結(jié)果附表川芎嗪含藥血清對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制作用,與空白組比較：※P＜0.05，與生理鹽水比較：▲P＜0.05。,74,例9,【實(shí)驗(yàn)結(jié)論】川芎嗪含藥血清對(duì)人肝癌Hep G2增殖有一定的抑制作用。[豐俊東，等：川芎嗪含藥血清對(duì)人肝癌細(xì)胞Hep G2增殖

54、的抑制作用，中草藥，2005，36（4）：551],75,例10,【樣 品】剔毒護(hù)肝方（黃芪 莪術(shù) 組成）全方及其拆方?！狙芯磕康摹刻接懱薅咀o(hù)肝方及其組成藥物黃芪、莪術(shù)、葉下珠對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖及端粒酶活性的影響。【腫瘤細(xì)胞】肝癌Bel-7402細(xì)胞珠。【動(dòng) 物】SD大鼠，♂，200 ~ 300g，3只/組。【給藥方案】剔毒護(hù)肝方全方0.3g/kg，黃芪0.09g/kg，莪術(shù)0.09g/kg，葉下珠0.12g/kg

55、分別給不同組別大鼠灌胃給藥，2次/日， 連續(xù)3日，第4天給予全日劑量后1小時(shí)，下腔靜脈采血，分離含藥血清，同組動(dòng)物血清混合。,76,例10,【血清處置】56℃，30分鐘滅活， -70℃保存。【實(shí)驗(yàn)體系】腫瘤細(xì)胞以1×105濃度接種于96孔版中，200μl/孔。每劑量組設(shè)4復(fù)孔。【血清加量】10%?！驹u(píng)價(jià)方法】MTT法測(cè)定樣品的細(xì)胞毒性，PCR-ELISA法測(cè)定端粒酶活性?！驹u(píng)價(jià)指標(biāo)】腫瘤生長抑制率，端粒酶活性抑制率。

56、【實(shí)驗(yàn)過程】腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后更換含藥血清，孵育48小時(shí)，加入MTT，測(cè)定吸光度，計(jì)算腫瘤生長抑制率；收集各組經(jīng)含藥血清處置的腫瘤細(xì)胞，按照試劑盒說明書所述方法進(jìn)行端粒酶活性測(cè)定。,77,例10,【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】詳見附表。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，剔毒護(hù)肝方全方能抑制人肝癌細(xì)胞的增殖和端粒酶活性，有一定的抗肝癌作用，進(jìn)一步拆方研究發(fā)現(xiàn)，方中莪術(shù)能抑制人肝癌細(xì)胞的增殖和端粒酶活性，而葉下珠和黃芪則無此作用。提示剔毒護(hù)肝方主要是通過方中莪術(shù)來發(fā)揮其抗癌

57、作用?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)論】剔毒護(hù)肝方具有抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用，其作用機(jī)制之一在于抑制腫瘤細(xì)胞端粒酶的活性，該方抗腫瘤的藥理作用主要來自于該組方中的莪術(shù)。[蔣小玲，等：剔毒護(hù)肝方及其拆方對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖及端粒酶活性的影響，中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2004，14（2）：91],78,例10實(shí)驗(yàn)結(jié)果附表。含藥血清對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響,與對(duì)照組比，※P＜0.01。,79,含藥血清對(duì)腫瘤細(xì)胞端粒酶活性的影響,與腫瘤細(xì)胞對(duì)照組比較，※P＜0.01。,80

58、,8血清藥理學(xué)研究中存在的問題,（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇無法達(dá)到理想狀態(tài)（2）含藥血清存在缺陷（3）無法確定最佳給藥方案（4）無法確定最佳采血時(shí)間（5）含藥血清是否滅活不統(tǒng)一（6）血清藥理很難做到既保證實(shí)驗(yàn)體系藥物濃度與血藥濃度相等又不影響組織及細(xì)胞的生長（7）藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)增加了藥物化學(xué)工作的難度,81,9血清藥理學(xué)工作的發(fā)展趨勢(shì),（1）血清藥理學(xué)方法的完善，主要是通過基礎(chǔ)學(xué)研究，對(duì)許多不確定的因素進(jìn)行探索，使得實(shí)驗(yàn)盡可能的規(guī)范化；