堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素－生物素法（sap法）

1、堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素－生物素法（SAP法）,免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)二,實(shí)驗(yàn)材料,1、小鼠胰腺的石蠟切片；2、胰島素抗體（鼠抗人單克隆抗體）；3、SAP檢測試劑盒；4、正常羊血清；5、 0.01M PBS（pH7.2～7.6） ；6、BCIP/NBT顯色試劑；7、孵育濕盒。,實(shí)驗(yàn)原理,ABC法,SAP法,實(shí)驗(yàn)方法或步驟,1、石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水洗，PBS浸泡2min；(如需采用 抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行

2、)。2、10％正常羊血清封閉，室溫孵育10min；3、傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的胰島素一抗或一抗工 作液，37℃孵育45min。 PBS沖洗，3×3min；4、滴加生物素標(biāo)記羊抗鼠IgG工作液，37℃孵育20min；5、 PBS沖洗，3×3min；6、滴加堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素工作液，37℃或室溫孵育 20min。 PBS沖洗，3×3min；7、

3、顯色劑顯色（BCIP/NBT）；8、自來水充分沖洗，封片。,結(jié)果,胰島內(nèi)可見藍(lán)色或紫藍(lán)色著色的陽性細(xì)胞，陽性產(chǎn)物見于細(xì)胞質(zhì),多聚鰲合物酶法 HRP---多聚化合物---抗體 一、Epos法 Enhanced polymer one-step staining,,,組織抗原,一抗,HRP,多聚化合物骨架,EPOS 方法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,原理：采用一種具有惰性的多聚

4、 化合物作為骨架，將特異 性抗體和HRP，同時標(biāo)記 在多聚合物分子上，形成 HRP---多聚化合物---特異 性抗體。,步驟：一步法特點(diǎn)：快速，簡便，特異性強(qiáng)， 敏感性高 但商品化種類不全， 價格昂貴,二、EnVision法（或PowerVison）

5、 Enhanced Labelled Polymer System 原理：HRP ---多聚化合物---第二 抗體,,組織抗原,一抗,二抗,酶,多聚化合物骨架,第一步,第二步,PowerVision方法,特點(diǎn)：敏感性高：（每個多聚鰲合物中含70個 HRP分子和10 個第二抗體） 特異性強(qiáng)： 復(fù)合物內(nèi)無內(nèi)源性Avidin和Biotin的干擾。,基本操作步驟,,1. 抗原修復(fù)2.內(nèi)源性過氧化 物抑

6、制3. 正常血清封閉,4. 第一抗體5. 多聚骨架復(fù)合物6. 顯色,,實(shí)驗(yàn)步驟1、石蠟切片脫蠟至水，PBS洗3×3min；2、3%H2O2室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化 物酶的活性；蒸餾水洗，PBS浸泡5min；3、滴加適當(dāng)比例稀釋的胰島素一抗工作液， 37℃ 孵育1hr；4、 PBS沖洗，3×3min；5、 滴加HRP標(biāo)記羊抗小鼠Ig多聚體，37