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文檔簡介
1、堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素法(SAP法),免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)二,實(shí)驗(yàn)材料,1、小鼠胰腺的石蠟切片;2、胰島素抗體(鼠抗人單克隆抗體);3、SAP檢測試劑盒;4、正常羊血清;5、 0.01M PBS(pH7.2~7.6) ;6、BCIP/NBT顯色試劑;7、孵育濕盒。,實(shí)驗(yàn)原理,ABC法,SAP法,實(shí)驗(yàn)方法或步驟,1、石蠟切片脫蠟至水,蒸餾水洗,PBS浸泡2min;(如需采用 抗原修復(fù),可在此步后進(jìn)行
2、)。2、10%正常羊血清封閉,室溫孵育10min;3、傾去血清,勿洗,滴加適當(dāng)比例稀釋的胰島素一抗或一抗工 作液,37℃孵育45min。 PBS沖洗,3×3min;4、滴加生物素標(biāo)記羊抗鼠IgG工作液,37℃孵育20min;5、 PBS沖洗,3×3min;6、滴加堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素工作液,37℃或室溫孵育 20min。 PBS沖洗,3×3min;7、
3、顯色劑顯色(BCIP/NBT);8、自來水充分沖洗,封片。,結(jié)果,胰島內(nèi)可見藍(lán)色或紫藍(lán)色著色的陽性細(xì)胞,陽性產(chǎn)物見于細(xì)胞質(zhì),多聚鰲合物酶法 HRP---多聚化合物---抗體 一、Epos法 Enhanced polymer one-step staining,,,組織抗原,一抗,HRP,多聚化合物骨架,EPOS 方法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,原理:采用一種具有惰性的多聚
4、 化合物作為骨架,將特異 性抗體和HRP,同時標(biāo)記 在多聚合物分子上,形成 HRP---多聚化合物---特異 性抗體。,步驟:一步法特點(diǎn):快速,簡便,特異性強(qiáng), 敏感性高 但商品化種類不全, 價格昂貴,二、EnVision法(或PowerVison)
5、 Enhanced Labelled Polymer System 原理:HRP ---多聚化合物---第二 抗體,,組織抗原,一抗,二抗,酶,多聚化合物骨架,第一步,第二步,PowerVision方法,特點(diǎn):敏感性高:(每個多聚鰲合物中含70個 HRP分子和10 個第二抗體) 特異性強(qiáng): 復(fù)合物內(nèi)無內(nèi)源性Avidin和Biotin的干擾。,基本操作步驟,,1. 抗原修復(fù)2.內(nèi)源性過氧化 物抑
6、制3. 正常血清封閉,4. 第一抗體5. 多聚骨架復(fù)合物6. 顯色,,實(shí)驗(yàn)步驟1、石蠟切片脫蠟至水,PBS洗3×3min;2、3%H2O2室溫孵育10min,以消除內(nèi)源性過氧化 物酶的活性;蒸餾水洗,PBS浸泡5min;3、滴加適當(dāng)比例稀釋的胰島素一抗工作液, 37℃ 孵育1hr;4、 PBS沖洗,3×3min;5、 滴加HRP標(biāo)記羊抗小鼠Ig多聚體,37
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