食品中化學物質(zhì)的生殖發(fā)育毒性和致畸作用及評價

1、本章學習目的與要求,掌握：生殖、發(fā)育毒性試驗的基本概念生殖毒性和發(fā)育毒性的表現(xiàn)生殖毒性試驗和發(fā)育毒性試驗的觀察指標理解：生殖毒性和發(fā)育毒性評價的試驗方法和設(shè)計原理了解：生殖發(fā)育毒性試驗的體外代替試驗,第一節(jié) 概述,生殖是使種族延續(xù)的各種生理過程的總稱。生殖過程一般是指從配子形成直到胎兒娩出的整個過程。其中包括精子的發(fā)生、卵的形成、配子的釋放、受精、卵裂和胚泡發(fā)育、著床、胚胎發(fā)生、胎兒發(fā)育、分娩。胎兒的娩出也并不意味著

2、胎兒發(fā)育成熟的終止，從廣義上說生殖還應(yīng)包括胎兒娩出后的新生兒期、哺乳期、直到性成熟的整個過程。,生殖毒性,發(fā)育（子體）毒性,生殖系統(tǒng)（親體）毒性,胚胎發(fā)育,胎兒發(fā)育,產(chǎn)后發(fā)育至性成熟,性欲、性行為,配子產(chǎn)生,生殖結(jié)局,激素水平,,,,一、外源化學物對生殖發(fā)育的影響,干擾生殖發(fā)育的任何環(huán)節(jié)，并造成損害作用?？梢酝ㄟ^對內(nèi)分泌系統(tǒng)，特別是對性腺的作用，發(fā)生間接的影響。神經(jīng)系統(tǒng)對內(nèi)分泌功能也有調(diào)節(jié)作用，通過下丘腦-垂體-睪丸軸(下丘腦

3、-垂體-卵巢軸)兩條途徑作用于生殖發(fā)育過程 。,二、外源化學物對生殖發(fā)育損害作用的特點,生殖發(fā)育過程較機體其他系統(tǒng)更為敏感 例如：妊娠期接觸過不足以引起腫瘤的低劑量二乙基亞硝胺，仔鼠成年后再次接觸，則腫瘤發(fā)生率增加。 外源化學物對生殖發(fā)育過程影響的范圍較為廣泛和深遠。 例如：母鼠接觸高濃度二硫化碳引起致畸作用，其子一代既使不再接觸二硫化碳，交配后所生的子二代仔鼠也出現(xiàn)與子一代仔鼠幾乎完全相同的畸變類型。,生殖發(fā)育毒理學：研

4、究出生前暴露于環(huán)境有害因子導(dǎo)致的異常發(fā)育結(jié)局及有關(guān)的作用機制、發(fā)病原理、影響因素和毒物動力學等的學科。生殖毒理學(reproductive toxicology)主要研究外源化學物對生殖細胞發(fā)生、卵細胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳過程的損害作用。 評定方法即為生殖毒性試驗。發(fā)育毒理學(developmental toxicology)主要研究外源化學物對胚胎發(fā)育、胎仔發(fā)育以及出生幼仔發(fā)育的影響。 評定方法稱為發(fā)育毒性

5、試驗，其中主要為致畸試驗。,三、基本概念,1940年澳大利亞風疹大流行，次年流行嬰兒先天性白內(nèi)障、耳聾、智力不全、先天性心臟病。1945年廣島長崎原子彈爆炸，受輻射兒童小頭畸形、智力低下，一年內(nèi)死亡率25%。1960年反應(yīng)停事件（thalidomide incident）， 歐洲出生8000多海豹畸形或海豹癥（phocomelus）兒童。1968年日本多氯聯(lián)苯污染米糠油事件，孕婦出現(xiàn)死產(chǎn)、早產(chǎn)、“油癥兒”。1961-1970年美

6、國在越戰(zhàn)中使用落葉劑2,4,5-T（含TCDD），孕婦流產(chǎn)、產(chǎn)下小頭和Down’s綜合征畸形兒。1966-1972年美國孕婦服用己烯雌酚，女性后代青春期陰道癌，男性后代成年后性功能低下、精子數(shù)下降。,四、歷史上的教訓(xùn),一、基本概念,1．發(fā)育毒性(developmental toxicity),指出生前經(jīng)父體和(或)母體接觸外源性理化因素引起的在子代到達成體之前出現(xiàn)的有害作用。胚胎期、胎兒期、產(chǎn)后生長發(fā)育期,第二節(jié) 發(fā)育毒性和致畸性

7、,發(fā)育毒性的表現(xiàn),（1）生長遲緩（2）致畸作用,發(fā)育毒性的表現(xiàn),（3）功能不全或異常,肝、腎、心功能不全。環(huán)境激素類物質(zhì)（鄰苯二甲酸酯） ，不僅關(guān)閉了胎兒Y染色體上的Sry基因，并且還轉(zhuǎn)變成了促進胚胎出現(xiàn)女性表征的雌性激素。,（4）胚胎或胎仔致死作用 流產(chǎn)、死產(chǎn)或死胎,2．畸形、畸胎和致畸物,畸形(malformation)：器官形態(tài)的異常。畸胎(terate)：致畸物(teratogen)：在一定劑量下，能通過母體對

8、胚胎或胎兒正常發(fā)育過程造成干擾，使子代出生后具有畸形的化合物。,二、致畸作用的毒理學特點,1．器官發(fā)生期的胚胎對致畸物最為敏感,受精卵發(fā)育為成熟個體的過程，包括：胚泡形成、著床、器官發(fā)生、胎兒發(fā)育、新生兒發(fā)育。大鼠器官發(fā)生期約為9-17天；小鼠器官發(fā)生期為7.5-16天；家兔為11-20天 ；人為3-12周。,2．劑量-效應(yīng)關(guān)系較為復(fù)雜,劑量增加，毒性作用增強，但與致畸性不成一定的比例。 胚胎致死作用增強，致畸作用降低。某

9、種致畸物可以引起一定的畸形，但在給予更高的劑量，并不出現(xiàn)同一類型的畸形。 例如環(huán)磷酰胺：低劑量——多趾，中等劑量——肢長骨縮短，高劑量——缺肢或無肢。許多致畸物除具有致畸作用外，還可能同時出現(xiàn)胚胎死亡和生長遲緩，不同表現(xiàn)相互影響，又無一定規(guī)律。,3．物種差異以及個體差異在致畸作用中為較為明顯,同一種致畸物對不同的動物并不一定都具有致畸作用，并且引起畸形的類型也不一致。 例如：反應(yīng)停對人類以及其它靈長類動物具有強烈致畸作

10、用，但對小鼠和家兔即使接觸較大劑量，其致畸作用仍極為輕微。同一物種動物的不同品系對一種致畸物敏感性的差別很大。 例如：口服反應(yīng)停，個體差異較大。,三、致畸作用機理（了解）,干擾基因表達基因突變與染色體畸變損傷細胞和分子水平的翻譯細胞調(diào)亡干擾細胞通過胎盤毒性引起發(fā)育毒性干擾母體穩(wěn)態(tài)內(nèi)分泌干擾作用,四、外源化學物發(fā)育毒性的評價,1．傳統(tǒng)致畸試驗,動物選擇劑量分組動物交配處理胎仔檢查數(shù)據(jù)處理結(jié)果評定,（1）動物

11、選擇食性和對受試物代謝過程與人類接近；體型小，馴服，容易飼養(yǎng)、繁殖及價廉；妊娠過程較短、每窩產(chǎn)仔數(shù)較多、胎盤構(gòu)造及厚度與人類接近。 大鼠（12-20只/組）,1．傳統(tǒng)致畸試驗,1．傳統(tǒng)致畸試驗,（2）劑量分組先進行預(yù)試驗，找出引起母體中毒的劑量；最高劑量組，可以引起母體輕度中毒，即進食量減少、體重減輕、死亡不超過10%；最低劑量組不應(yīng)觀察到任何中毒癥狀；中間劑量組可以允許母體出現(xiàn)某些極輕微中毒癥狀。,1．

12、傳統(tǒng)致畸試驗,（3）動物交配處理將性成熟雌雄動物按雌雄l：1或2：1比例同籠交配。每日將已確定受孕雌鼠隨機分入各劑量組和對照組。 受孕日確定由于致畸作用有極為明確的敏感期，應(yīng)精確掌握動物接觸受試物的時間，必須在器官發(fā)生期。,1．傳統(tǒng)致畸試驗,（4）胎仔檢查自然分娩前1-2日將受孕動物處死，剖腹取出活產(chǎn)胎仔（畸形檢查只限活產(chǎn)胎仔）。外觀畸形肉眼檢查，例如露腦；肉眼檢查內(nèi)臟及軟組織畸形，例如腭裂；

13、骨骼畸形檢查，例如顱頂骨缺損， 分叉肋等。,1．傳統(tǒng)致畸試驗,（5）數(shù)據(jù)處理活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù)畸形出現(xiàn)率 母體畸胎出現(xiàn)率致畸指數(shù)= 雌鼠LD50/最小致畸劑量,觀察指標,1．傳統(tǒng)致畸試驗,致畸性大?。褐禄笖?shù) 10以下為不致畸 10-100致畸 100以上強致畸,（6）結(jié)果評定是否具有致畸性：活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù)畸形出現(xiàn)率 母體畸胎出現(xiàn)率,2．發(fā)育毒性

14、的替代試驗（了解）,大鼠全胚胎培養(yǎng)胚胎細胞微團培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞試驗發(fā)育毒性的體內(nèi)預(yù)篩試驗(C .K.試驗),一、生殖毒性,包括：生殖細胞的發(fā)生、配子的釋放、卵細胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳過程。,外源化學物對生殖過程的損害作用，即生殖毒性（reproductive toxicity）。,第三節(jié) 生殖毒性及其評定,生殖毒性的表現(xiàn),性淡漠、性無能或各種形式的性功能減退。,雌性 排卵規(guī)律改變、經(jīng)期失調(diào)或閉經(jīng)、卵巢萎縮、生

15、殖能力的降低、受孕減少或不孕、胚胎死亡等。雄性 睪丸萎縮或壞死、精子數(shù)目減少。,,,一項統(tǒng)計顯示，目前，我國有育齡夫婦約2.3億人，其中有近1000萬不孕不育癥患者，而且每年以數(shù)十萬的速度遞增。也就是說，我國每10對育齡夫婦中就有1對遭遇生育問題，比30年前翻了10倍多！自發(fā)流產(chǎn)率可達全部妊娠中的50%。著床后的自發(fā)流產(chǎn)率為32%～34%。,2008年，解放軍174醫(yī)院生殖中心調(diào)查顯示，四成男性精子數(shù)量、質(zhì)量不正常。我國人

16、口和計劃生育委員會科學技術(shù)研究所，整理分析了北京、上海等39個市、縣的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，近25年來，我國男性的精液質(zhì)量正以每年1%的速度下降，精子數(shù)量降幅達40%以上；且工業(yè)化程度越高，該地區(qū)的精子質(zhì)量降低越明顯。 精子質(zhì)量降低已經(jīng)有低齡化的趨勢。2009年，武漢一家計生研究所曾經(jīng)在高校公開征精，但意外的是，前來捐精的400名大學生志愿者，精子合格的不到50人。,2004年，全國人大代表鐘南山院士在廣州分組討論會上說：“食品安全日趨嚴重

17、，50年后廣東的大多數(shù)人將喪失生育能力。”生育危機，隨科技進步和化學革命已經(jīng)降臨到人類頭上的。食品安全已成為破壞男女生育能力的禍首。對于直接和間接用于食品的化學物質(zhì)進行安全性評價是一項極為重要的任務(wù)。,1．精子的形成,精原細胞(休止狀態(tài)) 2n 有絲分裂(青春期)初級精母細胞 2n 減數(shù)分裂次級精母細胞 n 精細胞 n,精細胞轉(zhuǎn)變成成

18、熟精子精子生成或精子發(fā)生,,,,,人：72-90天小鼠：35天大鼠：48天兔：43天,二、雄性生殖毒性評價,2．毒物對雄性生殖的影響,對睪丸生精細胞的影響 精子生成障礙、引起生殖細胞突變。對內(nèi)分泌功能的影響 睪丸間質(zhì)細胞功能異常，有關(guān)激素合成或作用 發(fā)生改變。,3．雄性生殖毒性的檢測方法,（1）精子生成分析精子計數(shù)精子形態(tài)觀測精子狀態(tài)分析試驗（2）精子穿透試驗檢測精子在體外能否成功穿

19、透去透明帶的金黃地鼠卵子而受精的試驗。,（3）體外試驗睪丸支持細胞和間質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)。 （4）睪丸中標志酶活性的測定指標：乳酸脫氫酶X、山梨醇脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶；（5）雄性激素檢測指標：促性腺激素、黃體生成素、雄激素的含量,正常細胞電泳圖,受損細胞電泳圖,（6）雄性生殖細胞的遺傳毒性試驗 ——單細胞凝膠電泳試驗（彗星試驗）,（7）病理學檢查大體檢查：睪丸、附睪、前列腺及精囊的重量和形態(tài)；病理組織

20、學檢查,L：隱睪鼠的睪丸和附睪 R：正常鼠的睪丸和附睪,A ：正常雄性仔鼠的睪丸和附睪; B ：尿道下裂仔鼠的睪丸和附睪。 (×200）,三、雌性生殖毒性評價,1．雌性生殖細胞的生成過程,卵原細胞(休止狀態(tài)) 2n 有絲分裂(青春期)初級卵母細胞 2n 減數(shù)分裂次級卵母細胞 n 減數(shù)分裂 卵細胞 n

21、成熟卵子,,,,,2．毒物對雌性生殖系統(tǒng)的影響,對卵細胞的影響 卵母細胞數(shù)減少或突變對內(nèi)分泌功能的影響 影響受精、著床、胚胎發(fā)育、分娩等其它毒性作用 如對子代造成畸形、死胎、功能發(fā)育不全等。,生精細胞,3．雌性生殖毒性的檢測方法,雌性生殖毒性的檢測方法,,動物試驗,體外試驗,其他輔助試驗,,繁殖毒性試驗和致畸試驗,三段生殖試驗,,妊娠前期及初期,器官形成期,圍產(chǎn)期及授乳期,四、生殖毒性的評價,繁殖毒性試驗

22、作用：全面反映外源化學物對性腺功能、交配行為、受孕、妊娠過程、分娩、授乳以及幼仔斷乳后生長發(fā)育可能發(fā)生的影響。,1．繁殖毒性試驗設(shè)計,動物選擇：多用性成熟大鼠， 雌雄比例1:1或2:1。染毒：接觸受試物的方式可混入飼料或飲水中，由動物攝取，也可采用灌胃或腹腔注射。劑量分組：設(shè)三個劑量組，以及一個空白和溶劑對照組。 高劑量組：以超過人類實際接觸水平，能使新一代動物出現(xiàn)輕度中毒，死亡率不超過10%，不完全喪失生育能力。 低劑