第三章-醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)-人類基因組

1、第三章,人類基因組學(xué)Human Genomics,產(chǎn)生背景及概念,背 景　　1986年Dulbecco R等提出人類基因組計(jì)劃（HGP），隨著HGP的提出和實(shí)施，產(chǎn)生的基因組學(xué)。,概 念,以分子生物學(xué)技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)和信息網(wǎng)絡(luò)技術(shù)為研究手段，以生物體內(nèi)全部基因?yàn)檠芯繉?duì)象，在全基因背景下和整體水平上探索生命活動(dòng)的內(nèi)在規(guī)律及其內(nèi)外環(huán)境影響機(jī)制的科學(xué)。,2001年2月中旬，《Nature》與《Science》分別發(fā)表了人類基因組工

2、作框架圖,報(bào)告人類基因組共有30 億個(gè)堿基對(duì), 預(yù)測(cè)編碼基因31,000個(gè),比最初預(yù)測(cè)的10 萬(wàn)個(gè)編碼基因數(shù)大大減少。2003年人類基因組計(jì)劃宣布，人類基因組序列圖繪制成功，人類基因組計(jì)劃的所有目標(biāo)全部實(shí)現(xiàn),第　一　節(jié)人類基因組和基因組學(xué),基因組(genome)是德國(guó)遺傳學(xué)家H. Winkler在1920年將gene（基因）和chromosome(染色體)兩個(gè)詞縮合而創(chuàng)造的一個(gè)新詞，意思是指染色體上的全部基因。幾十年來(lái)，隨著分

3、子生物學(xué)的發(fā)展，其含義擴(kuò)展為在個(gè)體水平代表一個(gè)個(gè)體所有遺傳性狀的總和，在細(xì)胞水平代表一個(gè)細(xì)胞所有不同染色體（單倍體）的總和，在分子水平代表一個(gè)物種所有DNA分子的總和。,基因組學(xué)概念及范疇,基因組(genome),泛指一個(gè)有生命體、病毒或細(xì)胞器的全部遺傳物質(zhì)；在真核生物，基因組是指一套染色體（單倍體）DNA。,基因組學(xué)(genomics),就是發(fā)展和應(yīng)用DNA制圖、測(cè)序新技術(shù)以及計(jì)算機(jī)程序，分析生命體（包括人類）全部基因組結(jié)構(gòu)及功能的科

4、學(xué)。,,基因組學(xué)包括3個(gè)不同的亞領(lǐng)域結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structural genomics) 功能基因組學(xué)(functional genomics)比較基因組學(xué)(comparative genomics),基因組學(xué)概念,結(jié)構(gòu)基因組學(xué),結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structural genomics)是通過(guò)人類基因組計(jì)劃(Human Genome Project, HGP) 的實(shí)施來(lái)完成的。HGP的內(nèi)容就是制作高分辨率的人類遺

5、傳圖和物理圖，最終完成人類和其它重要模式生物全部基因組DNA序列測(cè)定，因此HGP屬于結(jié)構(gòu)基因組學(xué)范疇。,第　二　節(jié)人類基因組計(jì)劃,人類基因組計(jì)劃,HGP也稱人類基因測(cè)序計(jì)劃，主要目標(biāo)是完成對(duì)人的基因組的所有堿基序列的測(cè)定，闡明人體中全部基因的位置、結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)、調(diào)控方式及致病突變的全部信息?；救蝿?wù)是完成遺傳圖、物理圖、序列圖和轉(zhuǎn)錄圖。人類基因組包括 24條染色體，3×109bp，3-4萬(wàn)個(gè)基因。,人類基因組計(jì)劃的

6、目標(biāo),人類基因組計(jì)劃是一項(xiàng)國(guó)際性的研究計(jì)劃。它的目標(biāo)是通過(guò)以美國(guó)為主的全球性的國(guó)際合作，在大約15年的時(shí)間里完成人類24條染色體的基因組作圖和DNA全長(zhǎng)序列分析，進(jìn)行基因的鑒定和功能分析。人類基因組計(jì)劃的“科學(xué)產(chǎn)品”將是一個(gè)人類遺傳信息數(shù)據(jù)庫(kù)，將是一本指導(dǎo)人類進(jìn)化的“說(shuō)明書(shū)”。 人類基因組計(jì)劃的最終目標(biāo)就是確定人類基因組所攜帶的全部遺傳信息，并確定、闡明和記錄組成的人類基因組的全部DNA序列。,人類基因組計(jì)劃的研究概況 1

7、986年,1988年美國(guó)能源部和國(guó)家衛(wèi)生研究院率先在美國(guó)開(kāi)展人類基因組計(jì)劃，并經(jīng)國(guó)會(huì)批準(zhǔn)由政府給予資助。此后，成立了一個(gè)國(guó)際間的合作機(jī)構(gòu)——人類基因組織 (Human Genome Organization)，由多個(gè)國(guó)家籌集資金和科研力量，積極參加這一國(guó)際性研究計(jì)劃。,人類基因組計(jì)劃的研究概況 1988年,1989年，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院成立了人類染色體研究中心，沃森出任第一任主任。,人類基因組計(jì)劃的研究概況 1989年,1990

8、年，美國(guó)國(guó)會(huì)批準(zhǔn)了“人類基因組計(jì)劃”，并于10月1日正式啟動(dòng)，由多國(guó)科學(xué)家參加、被稱為“生命科學(xué)阿波羅計(jì)劃”的人類基因組計(jì)劃正式啟動(dòng)。預(yù)計(jì)用15年時(shí)間，投資30億美元，完成 30 億對(duì)堿基的測(cè)序，并對(duì)所有基因進(jìn)行繪圖和排序。美國(guó)承擔(dān)了全部任務(wù)的54%，英國(guó)33%，日本7%，法國(guó)2.8%，德國(guó)2.2%。中國(guó)于1999年9月加入人類基因組計(jì)劃并承擔(dān)了 1% 的測(cè)序任務(wù)。,人類基因組計(jì)劃的研究概況 1990年,1998年，生產(chǎn)DNA測(cè)序

9、儀的最大廠家Perkin-Elmer(簡(jiǎn)稱PE)公司與文特爾領(lǐng)導(dǎo)的基因研究所合作成立了塞萊拉（Celera）遺傳信息公司，并宣布他們將利用最新技術(shù)在3年內(nèi)完成人類基因組的測(cè)序工作，這使得該計(jì)劃處于一種公私競(jìng)爭(zhēng)的狀態(tài)，從而加快了人類基因組的研究步伐。,人類基因組計(jì)劃的研究概況 1998年,2000年6月26日，美國(guó)國(guó)家人類基因組研究所所長(zhǎng)弗朗西斯·柯林斯、塞萊拉公司的董事長(zhǎng)兼首席科學(xué)家克萊格·文特爾、美國(guó)總統(tǒng)克林頓

10、、英國(guó)首相布萊爾聯(lián)合宣布人類基因組工作草圖繪制成功。此后，人類基因組研究進(jìn)入繪制“完成圖”的階段。與“框架圖”相比， “完成圖”的覆蓋率從90％擴(kuò)展到100％，準(zhǔn)確率從99％上升到99.99％。,人類基因組計(jì)劃的研究概況 2000年,2001年2月12日，參加繪制人類基因組圖譜的美、英、日、法、德、中6國(guó)科學(xué)家公布了更加準(zhǔn)確、清晰、完整的人類基因組圖譜，并指出人類基因總數(shù)只有 3 ~ 3.5萬(wàn)個(gè), 編碼序列占2%。 2001年7

11、月10日，中國(guó)“人類基因組計(jì)劃”重大項(xiàng)目秘書(shū)長(zhǎng)楊煥明教授宣布：在人類基因組完成圖的繪制工作中，中國(guó)已率先超額（1.13%）完成所承擔(dān)的任務(wù)。,人類基因組計(jì)劃的研究概況 2001年,（一）遺傳圖 （二）物理圖 （三）序列圖 （四）基因圖,HGP包括以下研究?jī)?nèi)容,100-200 kb克隆片段,基因組測(cè)序的一般流程,分級(jí)鳥(niǎo)槍測(cè)序法,基因組DNA,細(xì)菌人工染色體文庫(kù),DNA克隆的排序

12、 （物理作圖）,分段測(cè)序,隨機(jī)打斷后克隆,DNA測(cè)序,DNA序列的組裝,一、 遺傳圖譜（連鎖圖譜）,概念：指基因或分子標(biāo)記在染色體上的相對(duì)位置與遺傳距離，用厘摩（cM）表示。1cM的遺傳距離表示在100個(gè)配子中有1個(gè)重組子。在哺乳動(dòng)物中，遺傳圖譜上1cM的距離大約相當(dāng)于物理圖譜上1,000,000bp。人類基因組的全長(zhǎng)約3600cM,遺傳圖是將每條染色體上的基因或遺傳標(biāo)記的相對(duì)位置經(jīng)連鎖分析確定下來(lái)，構(gòu)成圖譜，因

13、此，需借助相應(yīng)的遺傳標(biāo)記。 DNA技術(shù)的建立為人類提供了大量新的遺傳標(biāo)記。 遺傳標(biāo)記有三代,第一代DNA遺傳標(biāo)記是RFLP（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）。DNA序列上的微小變化，甚至1個(gè)核苷酸的變化，也能引起限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的丟失或產(chǎn)生，導(dǎo)致酶切片段長(zhǎng)度的變化。,第二代DNA遺傳標(biāo)記利用了存在于人類基因組中的大量重復(fù)序列：重復(fù)單位長(zhǎng)度在15-65個(gè)核苷酸左右的小衛(wèi)星DNA；重復(fù)單位長(zhǎng)度在2-6個(gè)核苷酸之間的微衛(wèi)星DNA，又稱為簡(jiǎn)短

14、串聯(lián)重復(fù)（STR、STRP或SSLP）。,第二代DNA遺傳標(biāo)記STRP的優(yōu)點(diǎn)是“多態(tài)性”與“高頻率”。由于(A)n，(CA)n，(CGG)n等短重復(fù)序列在進(jìn)化上不受選擇，在同一位點(diǎn)上可重復(fù)單位數(shù)量變化很大，配對(duì)時(shí)又容易產(chǎn)生“錯(cuò)配”，使這樣的位點(diǎn)遍布于整個(gè)基因組。已有5264個(gè)STRP為主體的遺傳標(biāo)記“連鎖圖”，平均分辨率已達(dá)600kb，其中第17號(hào)染色體上平均每495 kb有一個(gè)標(biāo)記，第9號(hào)染色體上平均每767 kb有一個(gè)標(biāo)記，整個(gè)

15、基因組中只有三處標(biāo)記間距大于4Mb。,第三代DNA遺傳標(biāo)記，可能也是最好的遺傳標(biāo)記，是分散于基因組中的單個(gè)堿基的差異，即單核苷酸的多態(tài)性（SNP），包括單個(gè)堿基的缺失、插入和替換。SNP中大多數(shù)為轉(zhuǎn)換，即由一種嘧啶堿基替換另一種嘧啶堿基，或由一種嘌呤堿基替換另一種嘌呤堿基，顛換與轉(zhuǎn)換之比為1：2。SNP有可能在密度上達(dá)到人類基因組“多態(tài)”位點(diǎn)數(shù)目的極限。估計(jì)人類基因組中可能有300萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)！SNP與RFLP和STRP標(biāo)記的主

16、要不同之處在于，它不再以DNA片段的長(zhǎng)度變化作為檢測(cè)手段，而直接以序列變異作為標(biāo)記。,遺傳圖譜繪制的意義“遺傳圖”的建立為人類疾病相關(guān)基因的分離克隆奠定了基礎(chǔ)。擁有5000多個(gè)遺傳學(xué)位點(diǎn)，相當(dāng)于把整個(gè)人類基因組劃分為5000多個(gè)小區(qū)，并分別設(shè)置了“標(biāo)牌”。如果在家系中證實(shí)該基因與某個(gè)標(biāo)記不連鎖（重組率為50%），表明該基因不在這一標(biāo)記附近。如果發(fā)現(xiàn)該基因與某個(gè)標(biāo)記有一定程度的“連鎖”（重組率小于50%但大于0），表明它可能位于這個(gè)標(biāo)

17、記附近。如果該基因與某標(biāo)記間不發(fā)生重組（重組率等于0），我們就推測(cè)該標(biāo)記與所研究的疾病基因可能非常接近。,人類基因組的物理圖是指以已知核苷酸序列的DNA片段（序列標(biāo)簽位點(diǎn)，STS）為“路標(biāo)”，以堿基對(duì)（bp，kb，Mb）作為基本測(cè)量單位（圖距）的基因組圖。STS是基因組中任何單拷貝的長(zhǎng)度在100～500bp之間的DNA序列，與核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列相關(guān)聯(lián)。物理圖主要內(nèi)容是建立相互重疊連接的“相連DNA片段群”。,物 理 圖,序 列 圖

18、人類基因組的核苷酸序列圖是分子水平上最高層次、最詳盡的物理圖。測(cè)定總長(zhǎng)約1米、由30億個(gè)核苷酸組成的全序列是人類基因組計(jì)劃的最終目標(biāo)。人類所擁有的基因位點(diǎn)都是相同的，不同種族、不同個(gè)體的基因差異(人類基因組的多樣性)以及“正常”與“疾病”基因的差異，只是同一位點(diǎn)上的等位基因的差異。人類基因組計(jì)劃所提供的人類核酸序列圖，蘊(yùn)藏了決定我們生、老、病、死的所有遺傳信息，將成為人類認(rèn)識(shí)自我、改造自我－使人類健康長(zhǎng)壽的知識(shí)源泉，為21世紀(jì)現(xiàn)代

19、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)奠定了基礎(chǔ)。,在識(shí)別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎(chǔ)上繪制的結(jié)合有關(guān)基因序列、位置及表達(dá)模式等信息的圖譜。 在人類基因組中鑒別出占具2%－5%長(zhǎng)度的全部基因的位置、結(jié)構(gòu)與功能，最主要的方法是通過(guò)基因的表達(dá)產(chǎn)物mRNA反追到染色體的位置。,基 因 圖,基 因 圖 CpG島的應(yīng)用,CpG島(CpG island)：描述哺乳動(dòng)物基因組DNA中的一部分序列，其特點(diǎn)是C和G的總和超過(guò)4種堿基總和的50%，即每10個(gè)核苷酸約出

20、現(xiàn)一次雙核苷酸序列CG。具有這種特點(diǎn)的序列僅占基因組DNA總量的10%左右。 從已知的DNA序列統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的管家基因(House-Keeping gene)及約占40%的組織特異性基因的5‘末端含有CpG島，其序列可能包括基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子及第一個(gè)外顯子。因此，在大規(guī)模DNA測(cè)序計(jì)劃中，每發(fā)現(xiàn)一個(gè)CpG島，則預(yù)示可能在此存在基因。,基 因 圖 計(jì)算機(jī)應(yīng)用及cDNA策略,計(jì)算機(jī)應(yīng)用：通過(guò)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)（生物信息學(xué)）cDNA策略

21、：把特定組織中的mRNA分離出來(lái)，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA片段，建立EST位標(biāo)，根據(jù)轉(zhuǎn)錄順序的位置和距離繪制的圖譜。 是染色體DNA某一區(qū)域內(nèi)所有可轉(zhuǎn)錄序列的分布圖，是基因圖的雛形。,,第三節(jié) 后基因組時(shí)代( Postgenome era),* 人類基因組計(jì)劃完成之后，生物學(xué)被重新劃分為前基因組和后基因組兩部分。* 科學(xué)研究已開(kāi)始進(jìn)入“后基因組時(shí)代”。主要是開(kāi)展蛋白質(zhì)組的研究。* 有科學(xué)家形象地說(shuō)道：即使基因測(cè)序全

22、部完成，也只好像是一本沒(méi)有姓名、只有號(hào)碼的電話簿?！昂蠡蚪M時(shí)代”的最終目標(biāo)，是要把深?yuàn)W的DNA語(yǔ)言變成一本基因大百科全書(shū)。,人類基因組工程(human genome projects)的含義,盡管工程規(guī)模和要處理的信息量都很大，但其技術(shù)難度似乎不好與阿波羅計(jì)劃和邁哈頓計(jì)劃相比。是人類了解生命現(xiàn)象過(guò)程中的重要一步，但它所能夠回答的問(wèn)題是有限的！它不會(huì)立刻使我們的壽命延長(zhǎng)。不會(huì)使我們立刻知道人類疾病的發(fā)病機(jī)理和治療方法。不會(huì)告訴我

23、們思維過(guò)程和個(gè)體發(fā)育的機(jī)制。不會(huì)告訴我們地球上的生命究竟是怎樣產(chǎn)生的。,人類基因組序列測(cè)完后（“后基因組時(shí)代”）的工作,分析所有的這些基因及其編碼產(chǎn)物（主要是蛋白質(zhì)）是如何單獨(dú)和共同在生命過(guò)程中發(fā)揮作用的 。在目前階段研究蛋白比研究基因難得多，而成千上萬(wàn)的結(jié)構(gòu)和功能都復(fù)雜多樣的蛋白分子才是生命過(guò)程的最后執(zhí)行者。我們現(xiàn)在還沒(méi)有有效的研究手段去揭示蛋白分子在生物體內(nèi)究竟完成什么功能、又是通過(guò)何種機(jī)制去完成其生物功能的等等。,一、基因組

24、多樣性計(jì)劃,不同人種、不同民族基因組的異同關(guān)系。探討人類進(jìn)化和種族演化的歷史。個(gè)體化用藥。疾病易感性。,二、功能基因組學(xué),完成一個(gè)生物體全部基因組測(cè)序后即進(jìn)入后基因組測(cè)序階段——詳盡分析序列，描述基因組所有基因的功能，包括研究基因的表達(dá)及其調(diào)控模式，這就是功能基因組學(xué)（functional genomics）。,（一）鑒定DNA序列中的基因（二）同源搜索設(shè)計(jì)基因功能 （三）實(shí)驗(yàn)性設(shè)計(jì)基因功能 （四）描述基因表達(dá)模式,功能基因

25、組學(xué)的主要具體內(nèi)容包括以下方面,功能基因組學(xué)研究策略及主要內(nèi)容,三、比較基因組學(xué),比較基因組學(xué)(comparative genomics)涉及比較不同物種的整個(gè)基因組，是利用生物在進(jìn)化上的親緣關(guān)系，來(lái)比較它們與人類之間的相似與相異，以便深入理解每個(gè)基因組的功能和進(jìn)化關(guān)系。,四、環(huán)境基因組學(xué)與環(huán)境因素相關(guān)的疾病遺傳易感性基因,五、疾病基因組學(xué) 分離、分析疾病的致病基因和相關(guān)基因，并研究其致病機(jī)制,六、藥物基因組學(xué)

26、 研究包括藥物在內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)引起機(jī)體反應(yīng)上的遺傳差異,以生物大分子為研究對(duì)象，以計(jì)算機(jī)為工具，運(yùn)用數(shù)學(xué)和信息科學(xué)的觀點(diǎn)、理論和方法去研究生命現(xiàn)象、組織和分析呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)的生物信息數(shù)據(jù)的一門(mén)科學(xué).,七、生物信息學(xué),http://www.ebi.ac.uk/embl/,http://www.ddbj.nig.ac.jp/。,http://www.ncbi.nlm.nih.gov,第四節(jié) 基因定位與克隆,人類基因組計(jì)劃的完成，最重要的后續(xù)

27、工作是運(yùn)用一定的方法，將各個(gè)基因確定到染色體的實(shí)際位置?；蚨ㄎ粚?duì)提高人類對(duì)疾病產(chǎn)生的病因?qū)W的認(rèn)識(shí)有重要意義。,1.連鎖分析（Linkage analysis）,基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點(diǎn)進(jìn)行定位。,基因定位的方法,重組值（recombination fraction） 是基因定位時(shí)兩個(gè)基因間遺傳圖距的量度，

28、即基因間的遺傳距離。如果兩個(gè)基因間有1%的重組值，其遺傳圖的距離為1厘摩。（centimorgan，cM）遺傳標(biāo)記（genetic marker） 用連鎖分析發(fā)法進(jìn)行基因定位需要已知的記憶內(nèi)作為遺傳標(biāo)記，這些標(biāo)記按孟德?tīng)柗绞竭z傳，標(biāo)記位點(diǎn)應(yīng)是多態(tài)的。,基因定位的方法,常用的連鎖分析方法為家系連鎖分析法采用對(duì)數(shù)優(yōu)勢(shì)記分法(Logoddsscore，LOD)數(shù)學(xué)模式,數(shù)學(xué)原理： 在獲得兩個(gè)基因位點(diǎn)的某上份系譜分析數(shù)據(jù)后

29、，將假定這兩個(gè)位點(diǎn)以某一重組值連鎖的似然性，與假定這兩個(gè)位點(diǎn)不連鎖的似然性相對(duì)較，從二者比值的對(duì)數(shù)值域，判斷支持和反對(duì)連鎖的優(yōu)勢(shì)。,L(0.5)表示重組值為50%，即完全不連鎖的似然性。Z≥3時(shí)可確定連鎖，Z≤-2時(shí)可否定連鎖，-2<Z<3時(shí)，須做進(jìn)一步分析,基因定位的方法,2、體細(xì)胞雜交法基因定位：體細(xì)胞：即生物體除生殖細(xì)胞外的任一細(xì)胞。體細(xì)胞雜交的概念： 也稱細(xì)胞融合（cell infusion），是將來(lái)

30、源不同的兩種細(xì)胞融合成一個(gè)新細(xì)胞。新產(chǎn)生的細(xì)胞稱雜種細(xì)胞（hybrid cell），含雙親不同的染色體。,對(duì)象： 人的細(xì)胞 鼠類：大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠 雜種細(xì)胞的特點(diǎn)： 在繁殖傳代過(guò)程中，人的染色體優(yōu)先丟失，以至最后只剩幾條或一條人的染色體，而嚙齒類的染色體被保留下來(lái)。,,原理： 細(xì)胞進(jìn)行融合時(shí)，培養(yǎng)液中只有部分細(xì)胞融合成雜種細(xì)胞，還有大量未融合的雙親細(xì)胞。這就需要選擇分離純化雜種細(xì)胞。為此要?jiǎng)?chuàng)造

31、一種只讓雜種細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而親本細(xì)胞死亡的環(huán)境。這就要利用雜種細(xì)胞和親本細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)條件的要求和代謝的差異來(lái)進(jìn)行選擇。其中最常用的是HAT選擇系統(tǒng)。,HAT選擇系統(tǒng),人的突變細(xì)胞株：缺乏HGPRT酶 小鼠細(xì)胞株：缺乏TK酶 兩者融合培養(yǎng)于HAT培養(yǎng)基中H 為次黃嘌呤，是HGPRT的底物，為DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）A 為氨基蝶呤，可阻斷正常的DNA合成(嘌呤及TMP合成受抑制)T 為胸腺嘧啶脫氧核苷，在胸

32、苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，為DNA合成提供原料,鼠細(xì)胞： 由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT可以利用次黃嘌呤合成腺嘌呤，鳥(niǎo)嘌呤，但由于無(wú)TK，無(wú)法合成胸腺嘧啶。(嘧啶合成障礙)雜種細(xì)胞： 有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鳥(niǎo)嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶(嘌呤和嘧啶都可以正常合成),人細(xì)胞：①由于A的存在，正常的DNA 合成通路受阻 。②同時(shí)由于HGPRT的缺乏，無(wú)法利用次黃嘌呤

33、通過(guò)旁路合成DNA(嘌呤合成障礙),因此在HAT培養(yǎng)基上，,將篩選出來(lái)的雜種細(xì)胞轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫學(xué)特性，Miller等運(yùn)用體細(xì)胞雜交并結(jié)合雜種細(xì)胞的特征，證明雜種細(xì)胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含有人17號(hào)染色體的雜種細(xì)胞都因有TK活性而存活，反之則死亡，從而推斷TK基因定位于17號(hào)染色體上，這是首例應(yīng)用體細(xì)胞雜交法進(jìn)行的基因定位。,3.原位雜交和熒光原位雜交,原位雜交（in situ h

34、ybridization） 是最直接的基因定位方法之一，是分子生物學(xué)技術(shù)在基因定位中的應(yīng)用，胰島素基因用此方法定位于11p15。原理 堿基的互補(bǔ)配對(duì)，同源的DNA-DNA雙鏈或DNA-RNA雙鏈在一定條件下能結(jié)合成雙鏈。用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA、RNA或與mRNA互補(bǔ)的cDNA作探針，可檢測(cè)細(xì)胞基因組中的同源部分。,,原位雜交的特點(diǎn) 雜交在載玻片上的中期染色體上進(jìn)行，而不是在溶液和膜上進(jìn)行。所

35、謂原位是指在標(biāo)本上DNA原位變性，再與放射性或非放射性物質(zhì)（通常用3H）標(biāo)記的已知核酸探針雜交，通過(guò)放射自顯影來(lái)檢測(cè)染色體上特異DNA或RNA順序，用放射性顆粒在某條染色體的區(qū)帶出現(xiàn)的最高頻率或熒光的強(qiáng)度來(lái)確定探針的位置，從而準(zhǔn)確地進(jìn)行基因定位。,原位雜交的步驟,制備中期染色體 DNA原位變性 變性 放射性或非放射性標(biāo)記探針

36、 雜交（在載玻片上） 洗膜 放射性標(biāo)記：放射自顯影 檢測(cè) 非放射性標(biāo)記：熒光染料與抗體或蛋白結(jié)合 記錄雜交信號(hào) 結(jié)合染色體形態(tài)進(jìn)行基因定位,,,,,,,,,熒光原位雜交（florescence in sit

37、u hybridization，F(xiàn)ISH）,用特殊熒光素（dig或Biotin）標(biāo)記探針DNA（Nick translation 標(biāo)記法），變性成單鏈后與變性后的染色體或細(xì)胞核靶DNA雜交。在熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。FISH優(yōu)點(diǎn)：可用來(lái)作基因或特定DNA片段的染色體區(qū) 域定位。缺點(diǎn)：必須在已知探針的情況下方可進(jìn)行。,單色FISH,多色FISH,放射雜種,是用射線輻射人體細(xì)胞染色體，使其隨機(jī)片段化，再與鼠細(xì)胞融合，形

38、成人/鼠細(xì)胞放射雜種，人的隨機(jī)染色體片段，整合入鼠細(xì)胞染色體中。構(gòu)建放射雜種細(xì)胞系克隆嵌板，可用于基因定位。,二、基因克隆 致病基因克隆有兩種基本策略 功能克隆 定位克隆1 功能克隆(functional cloning) 是利用疾病已知的遺傳損傷而引起的生化功能如蛋白質(zhì)氨基酸缺陷的信息,進(jìn)行基因定位,進(jìn)而克隆該基因,2 定位克隆(positional cloning)

39、 是先進(jìn)行基因定位作圖,然后找到來(lái)自該定位區(qū)的基因并進(jìn)行克隆,在此之后才能明確該基因的功能.功能克隆和定位克隆的比較 在傳統(tǒng)的功能克隆中,基因功能的研究先于基因鑒定.在定位克隆中,基因定位在先,最后再鑒定基因.基因已鑒定后,可以進(jìn)行基因功能的選擇性研究.,3 候選克隆,候選克隆策略是在已定位和已克隆的基因越來(lái)越多的背景下，形成的一種新的基因克隆途徑。 分為： 定位候選克隆 功能候選克隆