生化1-蛋白質(zhì)

1、生 物 化 學(xué),授課教師：盧韞 淮南師院化生系,,三 蛋白質(zhì),第B章 蛋白質(zhì)化學(xué),蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義,蛋白質(zhì)的元素組成,蛋白質(zhì)的氨基酸組成,肽,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,蛋白質(zhì)的性質(zhì),蛋白質(zhì)的分類,提要,蛋白質(zhì) 是由許多不同的α-氨基酸按一定的序列通過酰胺鍵（肽鍵）縮合而成的，具有較穩(wěn)定的構(gòu)象并具有一定生物功能的大分子。,一、蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義,1. 生物體的組成成分,2. 酶,3. 運輸,4. 運動

2、,5. 抗體,6. 干擾素,7. 遺傳信息的控制,8. 細(xì)胞膜的通透性,9. 高等動物的記憶、識別機構(gòu),二、蛋白質(zhì)的元素組成,C（50~55%）、H（6~8%）、O（20~23%）、N（15~18%）、 S（0~4%）、…,N的含量平均為16%——凱氏（Kjadehl）定氮法的理論基礎(chǔ),三、蛋白質(zhì)的氨基酸組成,氨基酸 是蛋白質(zhì)的基本組成單位。從細(xì)菌到人類，所有蛋白質(zhì)都由20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（20 standard amino acids)

3、組成。,（一）氨基酸的結(jié)構(gòu)通式：19種氨基酸具有一級氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）結(jié)合到α碳原子（Cα），同時結(jié)合到（Cα）上的是H原子和各種側(cè)鏈（R）；Pro具有二級氨基（α-亞氨基酸）,Cα如是不對稱C（除Gly），則：具有兩種立體異構(gòu)體 [D-型和L-型]2. 具有旋光性 [左旋（-）或右旋（+）],（二）氨基酸的分類,根據(jù)R的化學(xué)結(jié)構(gòu)（1）脂肪族氨基酸：1）疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、C

4、ys；2）極性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr（3）雜環(huán)氨基酸：Trp、His（4）雜環(huán)亞氨基酸：Pro,根據(jù)R的極性（1）極性氨基酸：1）不帶電：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；2）帶正電：His、Lys、Arg；3）帶負(fù)電：Asp、Glu（2）非極性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp,氨基酸類別,非

5、蛋白質(zhì)氨基酸,蛋白質(zhì)氨基酸（20種）,酸性氨基酸,天冬氨酸,谷氨酸,堿性氨基酸,賴氨酸,組氨酸,精氨酸,中性氨基酸,極性氨基酸,非極性氨基酸,絲氨酸,蘇氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,天冬酰氨,谷氨酰胺,,丙氨酸、甘氨酸,亮氨酸,異亮氨酸,苯丙氨酸,,甲硫氨酸,色氨酸,脯氨酸,頡氨酸,,,,,,,（三）氨基酸的重要理化性質(zhì),一般物理性質(zhì) 無色晶體，熔點極高（200℃以上），不同味道；水中溶解度差別較大（極性和非極

6、性），不溶于有機溶劑。,兩性解離和等電點 氨基酸在水溶液中或在晶體狀態(tài)時都以離子形式存在，在同一個氨基酸分子上帶有能放出質(zhì)子的—NH3+正離子和能接受質(zhì)子的—COO-負(fù)離子，為兩性電解質(zhì)。,3. 化學(xué)性質(zhì),（1）與茚三酮的反應(yīng)：Pro產(chǎn)生黃色物質(zhì)，其它為藍(lán)紫色。在570nm（藍(lán)紫色）或440nm（黃色）定量測定（幾μg）。,調(diào)節(jié)氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的—+NH3基和—COO-基的解離程度完全相等時

7、，即所帶凈電荷為零，此時氨基酸所處溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點（pI）。,（當(dāng)氨基酸相互連接成蛋白質(zhì)時，只有其側(cè)鏈基團和末端的α-氨基，α-羧基是可以離子化的。,氨基酸等電點的確定：,1）酸堿滴定（滴定曲線）,2）根據(jù)pK值（該基團在此pH一半解離）計算：等電點等于兩性離子兩側(cè)pK值的算術(shù)平均數(shù)。,（2）與甲醛的反應(yīng)：氨基酸的甲醛滴定法,OH-,中和滴定,（3）與2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng),,弱堿性,DNP-氨基酸,取代

8、DNFB測定蛋白質(zhì)N端氨基酸，靈敏度高,（4）與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應(yīng),,pH8.3,,無水HF,重復(fù)測定多肽鏈N端氨基酸排列順序，設(shè)計出“多肽順序自動分析儀”,（5）與熒光胺反應(yīng)：根據(jù)熒光強度測定氨基酸含量（ng級）。激發(fā)波長λx=390nm，發(fā)射波長λm=475nm。,（6）與5,5′-雙硫基-雙（2-硝基苯甲酸）反應(yīng)：,硫代硝基苯甲酸,測定Cys含量（pH8.0λ412nm的摩爾消光系數(shù)ε=13600）,四、肽,——一個

9、氨基酸的α-羧基和另一個氨基酸的α-氨基脫水縮合而成的化合物。 氨基酸之間脫水后形成的鍵稱肽鍵（酰胺鍵）。,當(dāng)兩個氨基酸通過肽鍵相互連接形成二肽，在一端仍然有游離的氨基和另一端有游離的羧基，每一端連接更多的氨基酸。氨基酸能以肽鍵相互連接形成長的、不帶支鏈的寡肽（25個氨基酸殘基以下）和多肽（多于25個氨基酸殘基）。多肽仍然有游離的α-氨基和α-羧基。,肽鏈寫法：游離α-氨基在左，游離α-羧基在右，氨基酸之間用“-”表示

10、肽鍵。,,H2N-絲氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-COOH,Ser-Leu-Phe,（S-L-F）,（一）谷光甘肽（GSH）,2GSH,GSSG,（二）催產(chǎn)素和升壓素,均為9肽，第3位和第9位氨基酸不同。催產(chǎn)素使子宮和乳腺平滑肌收縮，具有催產(chǎn)和促使乳腺排乳作用。升壓素促進(jìn)血管平滑肌收縮，升高血壓，減少排尿。,（三）促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）,39肽，活性部位為第4~10位的7肽片段： Met-Glu-His-Phe

11、-Arg-Trp-Gly。,（四）腦肽,腦啡肽具有強烈的鎮(zhèn)痛作用（強于嗎啡），不上癮。,Met-腦啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-腦啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu,β-內(nèi)啡肽（31肽）具有較強的嗎啡樣活性與鎮(zhèn)痛作用。,（五）膽囊收縮素,（六）胰高血糖素,由胰島α-細(xì)胞分泌（β-細(xì)胞分泌胰島素），29肽。胰高血糖素調(diào)節(jié) 維持血糖濃度。,五、 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)是氨基酸以肽鍵相互連接的線性序列。在蛋

12、白質(zhì)中，多肽鏈折疊形成特殊的形狀（構(gòu)象）（conformation）。在結(jié)構(gòu)中，這種構(gòu)象是原子的三維排列，由氨基酸序列決定。蛋白質(zhì)有四種結(jié)構(gòu)層次：一級結(jié)構(gòu)（primary），二級結(jié)構(gòu)（secondary），三級結(jié)構(gòu)（tertiary）和四級結(jié)構(gòu)（quaternary）（不總是有）。,（一）蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（化學(xué)結(jié)構(gòu)）,一級結(jié)構(gòu)就是蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序，即氨基酸的線性序列。在基因編碼的蛋白質(zhì)中，這種序列是由mRNA中的核苷酸序

13、列決定的。一級結(jié)構(gòu)中包含的共價鍵（covalent bonds）主要指肽鍵（peptide bond）和二硫鍵（disulfide bond）,牛胰島素的化學(xué)結(jié)構(gòu),一級結(jié)構(gòu)確定的原則：將大化小，逐段分析，制成兩套肽片段，找出重疊位點，排出肽的前后位置，最后確定蛋白質(zhì)的完整序列。,目前往往采用從待測蛋白質(zhì)的基因序列反推出蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。,（二）蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)（構(gòu)象、高級結(jié)構(gòu)）,——蛋白質(zhì)分子中所有原子在三維空間的排列分布和肽鏈的走向。

14、,由于羰基碳-氧雙鍵的靠攏，允許存在共振結(jié)構(gòu)（resonance structure），碳與氮之間的肽鍵有部分雙鍵性質(zhì)，由CO-NH構(gòu)成的肽單元呈現(xiàn)相對的剛性和平面化，肽鍵中的4個原子和它相鄰的兩個α-碳原子多處于同一個平面上。,氨基的H與羰基的O幾乎總是呈反式（trans）而不是順式（cis）。,蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定的原因：1）酰胺平面；2）R的影響。,1. 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu),——指蛋白質(zhì)多肽鏈本身的折疊和盤繞方式,（1）α-螺旋（α-h

15、elix）,Pauling和Corey于1965年提出。,結(jié)構(gòu)要點：1）螺旋的每圈有3.6個氨基酸，螺旋間距離為0.54nm，每個殘基沿軸旋轉(zhuǎn)100°。,2）每個肽鍵的羰基氧與遠(yuǎn)在第四個氨基酸氨基上的氫形成氫鍵（hydrogen bond），氫鍵的走向平行于螺旋軸，所有肽鍵都能參與鏈內(nèi)氫鍵的形成。,3.613 (ns),3)R側(cè)鏈基團伸向螺旋的外側(cè)。,4）Pro的N上缺少H，不能形成氫鍵，經(jīng)常出現(xiàn)在α-螺旋的端頭，它

16、改變多肽鏈的方向并終止螺旋。,（2）β-折疊結(jié)構(gòu)（β-pleated sheet）,是一種肽鏈相當(dāng)伸展的結(jié)構(gòu)。肽鏈按層排列，依靠相鄰肽鏈上的羰基和氨基形成的氫鍵維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。肽鍵的平面性使多肽折疊成片，氨基酸側(cè)鏈伸展在折疊片的上面和下面。,β-折疊片中，相鄰多肽鏈平行或反平行（較穩(wěn)定）。,（3）β-轉(zhuǎn)角（β-turn）,為了緊緊折疊成緊密的球蛋白，多肽鏈常常反轉(zhuǎn)方向，成發(fā)夾形狀。一個氨基酸的羰基氧以氫鍵結(jié)合到相距的第四個氨基酸的氨基

17、氫上。,,,,β-轉(zhuǎn)角經(jīng)常出現(xiàn)在連接反平行β-折疊片的端頭。,（4）自由回轉(zhuǎn),沒有一定規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu)。酶的活性部位。,2. 超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域,超二級結(jié)構(gòu)是指若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象單元彼此相互作用，形成有規(guī)則的，在空間上能辨認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)組合體。是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)至三級結(jié)構(gòu)層次的一種過渡態(tài)構(gòu)象層次。,結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位。多肽鏈在超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步繞曲折疊成緊密的近似球行的結(jié)構(gòu)，具有部分生物功能。對于較大的蛋白質(zhì)分子或

18、亞基，多肽鏈往往由兩個以上結(jié)構(gòu)域締合而成三級結(jié)構(gòu)。,3. 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu),——指多肽鏈上的所有原子（包括主鏈和側(cè)鏈）在三維空間的分布。,肌紅蛋白,4. 蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu),——多肽亞基（subunit）的空間排布和相互作用。亞基間以非共價鍵連接。,血紅蛋白,共價鍵,次級鍵,,化學(xué)鍵,肽鍵,,一級結(jié)構(gòu),氫鍵,二硫鍵,,,,二、三、四級結(jié)構(gòu),疏水鍵,鹽鍵,范德華力,,,,三、四級結(jié)構(gòu),（三）蛋白質(zhì)分子中的共價鍵與次級鍵,肌紅蛋白是195

19、7年由John Kendrew 用X射線晶體分析法測定的有三維結(jié)構(gòu)的第一個蛋白質(zhì)。它是典型的球形蛋白質(zhì)，高度折疊成緊密結(jié)構(gòu)，疏水氨基酸殘基大部分埋藏在分子內(nèi)部，極性殘基在表面。肌紅蛋白中有8條α-螺旋。由多肽的折疊形成的疏水空隙內(nèi)是血紅素輔基，通過肽鏈上的His殘基與肌紅蛋白分子內(nèi)部相連，它對肌紅蛋白的生物活性是必需的（與O2結(jié)合）。,六、蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,蛋白質(zhì)分子具有多樣的生物學(xué)功能，需要一定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，還需要一定的空間構(gòu)

20、象。,（一）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,1. 種屬差異,蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的種屬差異十分明顯，但相同部分氨基酸對蛋白質(zhì)的功能起決定作用。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的差異，可以斷定它們在親緣關(guān)系上的遠(yuǎn)近。,2.分子病,——蛋白質(zhì)分子一級結(jié)構(gòu)的氨基酸排列順序與正常有所不同的遺傳病。,鐮狀細(xì)胞貧血（sick-cell anemia）從患者紅細(xì)胞中鑒定出特異的鐮刀型或月牙型細(xì)胞。,β-鏈 1 2 3

21、 4 5 6 7Hb-A Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys…Hb-S Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys…,,Val 取代Glu,O2,O2,,（二）蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的關(guān)系,別（變）構(gòu)作用：含亞基的蛋白質(zhì)由于一個亞基的構(gòu)象改變而引起其余亞基和整個分子構(gòu)象、性質(zhì)和功能發(fā)生改變的作用。因別構(gòu)而產(chǎn)生的效應(yīng)稱別構(gòu)

22、效應(yīng)。,血紅蛋白是別構(gòu)蛋白，O2結(jié)合到一個亞基上以后，影響與其它亞基的相互作用。,Gly的滴定曲線,Gly解離作用,七、蛋白質(zhì)的性質(zhì),（一）蛋白質(zhì)的相對分子量,蛋白質(zhì)相對分子量在10 000~1 000 000之間。測定分子量的主要方法有滲透壓法、超離心法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。,最準(zhǔn)確可靠的方法是超離心法（Svedberg于1940年設(shè)計）：蛋白質(zhì)顆粒在25~50*104 g離心力作用下從溶液中沉降下來。,沉降系數(shù)（s）：

23、單位（cm）離心場里的沉降速度。,v =沉降速度（dx/dt）ω=離心機轉(zhuǎn)子角速度（弧度/s） x =蛋白質(zhì)界面中點與轉(zhuǎn)子中心的距離（cm）,沉降系數(shù)的單位常用S，1S=1×10-13（s）,蛋白質(zhì)分子量（M）與沉降系數(shù)（s）的關(guān)系,（二）蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點,蛋白質(zhì)在其等電點偏酸溶液中帶正電荷，在偏堿溶液中帶負(fù)電荷，在等電點pH時為兩性離子。,電泳：帶電顆粒在電場中移動的現(xiàn)象。分子大小不同的蛋白質(zhì)所帶凈電荷密度不同，

24、遷移率即異，在電泳時可以分開。,1. 自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進(jìn)行電泳。,2. 區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點在浸了緩沖液的支持物上進(jìn)行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。,（1）紙上電泳：用濾紙作支持物。,（2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。,1）圓盤電泳：玻璃管中進(jìn)行的凝膠電泳。,2）平板電泳：鋪有凝膠的玻板上進(jìn)行的電泳。,等電聚焦電泳：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點時，凈電荷為零，在電場中不再移動。,,通電,（三）蛋白質(zhì)的

25、膠體性質(zhì),布郎運動、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象，不能透過半透膜，具有吸附能力,蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的原因：1）表面形成水膜（水化層）； 2）帶相同電荷。,（四）蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng),1. 加高濃度鹽類（鹽析）：加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出。,分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4飽和度），清蛋白（飽和(NH4)

26、2SO4)。,2. 加有機溶劑,3. 加重金屬鹽,4. 加生物堿試劑,單寧酸、苦味酸、鉬酸、鎢酸、三氯乙酸能沉淀生物堿，稱生物堿試劑。,（五）蛋白質(zhì)的變性,天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響，其共價鍵不變，但分子內(nèi)部原有的高度規(guī)律性的空間排列發(fā)生變化，致使其原有性質(zhì)發(fā)生部分或全部喪失，稱為蛋白質(zhì)的變性。,變性蛋白質(zhì)主要標(biāo)志是生物學(xué)功能的喪失。溶解度降低，易形成沉淀析出，結(jié)晶能力喪失，分子形狀改變，肽鏈松散，反應(yīng)基團增加，易被酶消化。

27、,變性蛋白質(zhì)分子互相凝集為固體的現(xiàn)象稱凝固。,有些蛋白質(zhì)的變性作用是可逆的，其變性如不超過一定限度，經(jīng)適當(dāng)處理后，可重新變?yōu)樘烊坏鞍踪|(zhì)。,,（六）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),—OH,N,,,,,,（7）成鹽反應(yīng),,（8）?；蜔N基化反應(yīng),,（9）成酯反應(yīng),,HCl氣,當(dāng)羧基變成乙酯后，羧基的化學(xué)性質(zhì)就被掩蔽了，而氨基的化學(xué)性質(zhì)就突出地顯示出來。,（10）酰氯化反應(yīng),,使氨基酸的羧基活化，易于另一氨基酸的氨基結(jié)合，在合成肽的工作上常用。,（11）

28、成酰胺反應(yīng),H2N—CHR—COOC2H5 + HNH2,,體外,無水,有機體內(nèi)：,Asp（Glu）+NH4+,Asn（Gln）,,Asn（Gln）合成酶,ATP,（12）脫羧反應(yīng),H2N—CHR—COOH,,脫羧酶,（13）迭氮反應(yīng),H2N-CHR-COOH,,,NH2NH2,（-CH3OH）,,HNO2,八、蛋白質(zhì)的分類,1. 蛋白質(zhì)形狀,球狀蛋白,纖維狀蛋白,,2. 分子組成,簡單蛋白（按溶解度）,結(jié)合蛋白（按輔基）,,核蛋白,糖