gbs核酸檢測(cè)課件

1、GBS核酸檢測(cè),GBS概述,GBS概述,B族鏈球菌(Group B Streptococcus,GBS)學(xué)名無乳鏈球菌，革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌，正常寄居于陰道和直腸，屬于條件致病菌。,在20世紀(jì)70年代，GBS已被證實(shí)為圍產(chǎn)期母嬰感染的主要致病菌之一，在圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)中占有不可忽視的地位。,什么是圍產(chǎn)期……,國(guó)外研究表明 ，不同地區(qū)、不同種族的妊娠晚期婦女GBS帶菌率約為6.5％～36.0％，國(guó)內(nèi)報(bào)道的妊娠婦女GBS帶菌率為3.5%～32.4

2、％，新生兒體表帶菌率與母體帶菌率相似。在一些特殊人群，如肥胖、糖耐量異常、多次妊娠以及性生活活躍的婦女中帶菌率較高。,人群GBS帶菌率,是指懷孕28 周到產(chǎn)后一周這一分娩前后的重要時(shí)期 圍產(chǎn)期保健是指產(chǎn)前、產(chǎn)時(shí)和產(chǎn)后的一段時(shí)間內(nèi)，對(duì)母親、胎兒和新生兒進(jìn)行一系列的保健工作，使母親健康和胎兒、新生兒的成長(zhǎng)發(fā)育得到很好的保護(hù)。,GBS對(duì)孕婦的影響,GBS感染是胎膜早破的重要發(fā)病因素 GBS對(duì)絨毛膜有較強(qiáng)吸附能力和穿透能力，接種

3、2小時(shí)內(nèi)即可吸附于母體組織，繼而侵入絨毛膜，通過炎癥細(xì)胞的吞噬作用及細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白水解酶的直接侵襲，使胎膜局部張力減低，從而導(dǎo)致胎膜早破 。GBS生殖道感染是導(dǎo)致早產(chǎn)的重要因素 GBS引起泌尿生殖道感染時(shí)，會(huì)引起磷脂酶A2和前列腺素及細(xì)胞因子的釋放，刺激子宮收縮導(dǎo)致早產(chǎn)。GBS是造成產(chǎn)褥感染的主要致病菌之一 產(chǎn)褥感染是指分娩時(shí)及產(chǎn)褥期生殖道受病原體感染，引起局部和全身的炎性應(yīng)化。產(chǎn)褥感染發(fā)病率為1%～7.2%，是產(chǎn)

4、婦死亡的原因之一 。,GBS對(duì)新生兒的影響,GBS感染是新生兒感染的主要原因早發(fā)型感染 多見于出生后1周內(nèi)。母嬰垂直傳播是其主要傳播途徑。主要臨床表現(xiàn)為敗血癥（80%）、肺炎（7%）、腦膜炎（6%）；若治療不及時(shí)，可引發(fā)遠(yuǎn)期后遺癥，如智力發(fā)育遲緩、視覺聽覺喪失等。,晚發(fā)型感染 多發(fā)生于出生1周后。 主要為水平傳播：可能與院內(nèi)感染或家庭接觸有關(guān)。 常呈隱匿性發(fā)病，其特征表現(xiàn)為腦膜炎；1/3的晚發(fā)型疾病出現(xiàn)腦膜炎，故這些

5、生存下來的新生兒中更易發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。,GBS的傳播與感染,國(guó)內(nèi)外GBS篩查現(xiàn)狀,美國(guó)疾病控制中心(CDC) 制定了《圍產(chǎn)期GBS預(yù)防指南》,該指南已經(jīng)獲得以下認(rèn)可：美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)院美國(guó)兒科學(xué)會(huì)美國(guó)護(hù)士助產(chǎn)士協(xié)會(huì)美國(guó)家庭醫(yī)生協(xié)會(huì)美國(guó)微生物學(xué)會(huì)美國(guó)流行病學(xué)會(huì)美國(guó)藥理學(xué)會(huì),在我國(guó)，2011年，中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)產(chǎn)科學(xué)組在《孕前和孕期保健指南(第1版)》中已將B族鏈球菌篩查作為一個(gè)備查項(xiàng)目。,《圍產(chǎn)期GBS預(yù)防指南》指出,

6、對(duì)所有孕婦于妊娠35～37 周進(jìn)行GBS篩查，結(jié)果陽(yáng)性者進(jìn)行預(yù)防性治療以下情況應(yīng)進(jìn)行預(yù)防性治療 ：本次妊娠有GBS 菌尿上次新生兒GBS 感染史 在妊娠37 周之前分娩 破膜時(shí)間超過18小時(shí) 分娩體溫超過38.0度,GBS的篩查與預(yù)防,預(yù)防GBS疾病的抗生素使用方案舉例:,《圍產(chǎn)期GBS預(yù)防指南》指出： GBS陽(yáng)性患者應(yīng)用抗生素進(jìn)行預(yù)防性治療Boyer在1989年研究中指出，產(chǎn)時(shí)氨芐青霉素使用超過1小

7、時(shí)就可以使得新生兒感染從28%減少到4%。LIN在2001年的研究中表明，與無產(chǎn)時(shí)應(yīng)用抗生素相比，抗生素預(yù)防超過2小時(shí)的有效率是89%，不足2小時(shí)的有效率為71%。,挑戰(zhàn)：我媽媽會(huì)進(jìn)行IAP治療嗎？,《圍產(chǎn)期GBS預(yù)防指南》,GBS檢測(cè)方法比較,PCR介紹,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡(jiǎn)稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段；可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。,什么是PCR…

8、…,PCR原理,PCR一般由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 。②退火 ：（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。 ③延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端→5′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。 每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍;2～3小時(shí)就能將待

9、擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。,PCR原理,PCR反應(yīng)體系,PCR反應(yīng)體系中的主要試劑有：,PCR擴(kuò)增儀,PCR溫度循環(huán)至關(guān)重要，PCR擴(kuò)增儀各參數(shù)必須準(zhǔn)確。 現(xiàn)已有幾十家不同的廠家在國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)和銷售PCR擴(kuò)增儀。國(guó)外廠家：Bio-Rad，ABI, Roche …… 國(guó)內(nèi)廠家：杭州朗基 ，杭州博日……,PCR反應(yīng)特點(diǎn),特異性強(qiáng)：引物與模板DNA特異正確結(jié)合 ，堿基配對(duì)原則 ，Taq DNA聚合酶忠實(shí)性擴(kuò)增靈敏度高 ：PCR產(chǎn)物

10、的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克（μg=10-6）水平 簡(jiǎn)便快速：一般在1～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng) 模板純度要求低 ：不需要分離病毒/細(xì)菌/培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板,1. 每擴(kuò)增一條DNA鏈，就切斷一個(gè)探針2. 每切斷一個(gè)探針，就產(chǎn)生一個(gè)單位熒光信號(hào)3. 熒光信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比,實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)：是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)

11、，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過擴(kuò)增曲線對(duì)模板進(jìn)行分析的方法。,GBS核酸檢測(cè)產(chǎn)品,熒光PCR檢測(cè)B族鏈球菌（GBS）,,B族鏈球菌(GBS)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法),Taqman 探針實(shí)時(shí)PCR技術(shù)選擇B族鏈球菌基因組特異且無高頻SNP位點(diǎn)的序列區(qū)域cAMP因子，設(shè)計(jì)特異性引物和探針內(nèi)參照系統(tǒng)排除PCR反應(yīng)過程中可能的假陰性結(jié)果UNG酶避免擴(kuò)增污染物造成的假陽(yáng)性適用儀器：Roche LightC

12、ycler 480，ABI 7500，Bioer Line-Gene K等多色熒光PCR儀,產(chǎn)品特點(diǎn),規(guī)格：20人份/盒有效期：－18 ℃以下避光保存6個(gè)月試劑：DNA提取液、GBS PCR反應(yīng)液、GBS陽(yáng)性對(duì)照品，空白對(duì)照品標(biāo)本類型：生殖道/直腸等部位帶上皮細(xì)胞的分泌物標(biāo)本,試劑盒介紹,溶血樣本、保婦康栓、皮炎平對(duì)檢測(cè)結(jié)果有顯著影響，應(yīng)盡量避免這些樣本的檢測(cè)。 其他常見干擾物質(zhì)（粘液和膿液）以及常用藥物（青霉素G、阿奇

13、霉素、強(qiáng)力霉素及氧氟沙星、聚甲酚磺醛溶液、潔爾陰洗液、黃硝呋太爾制霉素陰道軟膠囊、肛泰軟膏、開塞露）均無明顯影響。,待測(cè)樣本在2-8℃保存不應(yīng)超過24小時(shí)；-18℃以下保存不超過4天。,標(biāo)本要求,標(biāo)本保存,檢測(cè)流程（ ＜ 2 h ）,DNA提取,1mL標(biāo)本,沉淀+1mL生理鹽水,沉淀+ 50μL DNA提取液,99-100 ℃加熱10min,取上清至1.5mL離心管中保存,,,,,13,000 rpm 10 min,13,000

14、 rpm 5 min,13,000 rpm 10 min,標(biāo)本，GBS陽(yáng)性對(duì)照品，空白對(duì)照品均需要提取DNA。,PCR體系配制40 μL 體系：35 μL PCR反應(yīng)液 + 5 μL DNA模板,PCR擴(kuò)增程序： 50℃ 2min 95℃ 5min,,,（ 95℃ 15s,60℃ 35s ）,45 cycles,,實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過程,FAM 通道

15、 HEX通道,FAM通道檢測(cè)結(jié)果：分析樣本，空白對(duì)照品： Ct值不顯示；陽(yáng)性對(duì)照品： Ct<30.00； HEX通道檢測(cè)結(jié)果： 分析內(nèi)參照基因，Ct≤35.00,陰性：樣品的FAM通道無Ct值顯示, HEX通道Ct≤35.00 陽(yáng)性： 樣品的FAM通道 Ct≤38.00， HEX通道Ct≤35.00備注：若樣品的FAM通道 38.00<Ct≤45.00，建

16、議重新檢測(cè)該樣本， 若重檢結(jié)果仍為38.00<Ct≤45.00或Ct≤38.00，判定為陽(yáng)性； 若Ct不顯示且HEX通道Ct≤35.00，判定為陰性。,結(jié)果有效性判定,結(jié)果分析,以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足,產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)一,靈敏度高：采用PCR方法檢測(cè)DNA，試劑與國(guó)際領(lǐng)先試劑性能相同 特異性強(qiáng)：不與臨床常見其它各類病原體產(chǎn)生交叉反應(yīng) 穩(wěn)定性好：樣本DNA提取質(zhì)量高，陽(yáng)性對(duì)照品、空白對(duì)照品內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線高度吻合

17、，試劑穩(wěn)定 無污染：全封閉PCR體系，避免實(shí)驗(yàn)室其它PCR產(chǎn)物污染 易操作：操作簡(jiǎn)便，采用預(yù)制PCR反應(yīng)液，無需額外加入內(nèi)參照基因、酶等 速度快：檢測(cè)周期短，從核酸提取到PCR結(jié)束實(shí)驗(yàn)過程不到2小時(shí),產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)二,公司GBS、 UU (解脲脲原體)、NG（淋球菌）、CT（沙眼衣原體）四 個(gè)核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣本類型，DNA提取步驟和PCR擴(kuò)增程序相同，結(jié)果閾值線的設(shè)定也相同；四個(gè)病原體可以同時(shí)依次進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增步驟