核酸免疫進(jìn)展課件

1、核酸疫苗,一、概 述,核酸疫苗又稱基因疫苗或DNA疫苗，就是把外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上，然后將重組的質(zhì)?；蛑苯用庖邫C體 ，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應(yīng)。,（一）概 念,（二）DNA疫苗的構(gòu)成： 1. 抗原表達(dá)基因 2. 真核細(xì)胞啟動子（如CMV I.E啟動子） 3. Poly A 終止序列（如來自SV40 或 BGH基因） 4. 原核細(xì)胞選

2、擇標(biāo)志（如青霉素抗性基因） 5. 增強免疫原性的核苷酸序列（如非甲基化CpG二核苷),二、DNA疫苗載體,1. 裸DNA疫苗：質(zhì)粒、 MIDGE載體2. 病毒載體： 天花病毒、腺病毒 3. 細(xì)菌載體：減毒活菌苗和繁殖缺陷細(xì)菌，如傷寒菌苗、腸炎沙門氏菌苗、志賀氏菌苗、單核細(xì)胞增生李斯特菌苗和小腸炎耶爾森氏菌苗4. 微粒包裹載體：金顆粒(gold particle)、脂質(zhì)體(liposomes)、聚丙交酯-聚乙交酯（PLGA）

3、、藻酸鹽微粒(alginate)、和納米微粒(nanoparticles),Various methods of gene delivery,三、DNA疫苗與常規(guī)疫苗的比較,DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較,DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較(續(xù)1）,DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較(續(xù)2）,核酸疫苗與第一、二代疫苗相比具有如下優(yōu)勢：,(1)誘導(dǎo)機體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答，其保護(hù)性免疫應(yīng)答對不同亞型的病原體具有交叉抵御作用；(2)無減毒、滅活疫苗可能引起的致病作用

4、，具有可靠的安全性；(3)能表達(dá)經(jīng)修飾的天然抗原，具有與天然抗原相同的構(gòu)象和抗原性；(4)與亞單位疫苗共有的高產(chǎn)性；(5)可將編碼不同抗原的基因構(gòu)建在同一個質(zhì)粒中，或?qū)⒉煌乖虻亩喾N重組質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用，制備多價核酸疫苗；(6)核酸疫苗既有預(yù)防作用，也有治療作用；(7)生產(chǎn)簡便，成本低廉，穩(wěn)定性好，貯運方便。,四、核酸疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng),核酸疫苗誘導(dǎo)的全身免疫應(yīng)答反應(yīng) 關(guān)于核酸疫苗誘導(dǎo)全身免疫應(yīng)答反應(yīng)的機制目前了解的還

5、不十分清楚，但其誘導(dǎo)過程可大致分為以下幾個階段：①疫苗的攝取、轉(zhuǎn)運及表達(dá)；②抗原的加工和提呈；③淋巴細(xì)胞的活化；④免疫效應(yīng)細(xì)胞和分子的作用。,Immune mechanisms induced by inoculation with naked DNA,Depiction of the mechanisms of generation of antigen-specific humoural and cellular respo

6、nses.,五、核酸疫苗的構(gòu)建,1、將亞單位疫苗的編碼基因作為核酸疫苗的候選基因。 2、多肽合成疫苗的核酸推導(dǎo)序列作用核酸疫苗的候選基因 3、從病原體亞單位成分中篩選保護(hù)性抗原及編碼基因 3．1 免疫篩選法 3．2 化學(xué)分解法,候選基因的篩選原則,,,,Ligate PCR product into pTARGETTM Vector,,Transform TG1 cells,,Selecte recombinant clones

7、 by ampicillin,,pstⅠ酶切鑒定,挑取S基因正向插入的重組質(zhì)粒pTARGET-hanS測序,,重組質(zhì)粒pTARGET-hanS的構(gòu)建:,引物1:CT ACT ATG GCA ACT ATG GAG GAA引物2:AC TAA TTA GAG TTT CAA AGG CTC,PCR,,,正向: 酶切成3674，1870，1470反向: 可酶切成3674，2600,740,,可酶切成5.6kb和1.3kb左右兩個片段,,

8、EcoRⅠ酶切,,瓊脂糖凝膠電泳,,回收5.6kb左右的大片段,對照空載體pTARGET的構(gòu)建：,,用連接酶連接,成為閉環(huán)pTARGET空載體,作為對照載體備用。,培養(yǎng)Vero-E6細(xì)胞,,MEM培養(yǎng)基(10%FCS),37℃，5%CO2,細(xì)胞長至對數(shù)生長期,電穿孔轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒,,轉(zhuǎn)染后72h，收獲細(xì)胞,,檢測核蛋白的瞬時表達(dá),熒光顯微鏡下觀察并拍照。,間接免疫熒光法,重組質(zhì)粒pTARGET-hanS體外瞬間表達(dá):,,,核蛋白的瞬時表達(dá)

9、結(jié)果,,pcDNA3.1+S的酶切鑒定結(jié)果,1．pcDNA3.1+S 質(zhì)粒（6.7kb）2．pcDNA3.1+S pstⅠ酶切 （5.0kb，1.7kb）3. pcDNA3.1+S（ISS）pstⅠ酶切,作為DNA免疫的注射樣品。,質(zhì)粒的大量制備及純化:,按分子克隆手冊所述方法提純質(zhì)粒pcDNA3.1+和 pcDNA3.1+S,,用滅菌的PBS溶解,,調(diào)整濃度至1.0mg/ml,用分光光度計測定A260/A280比值以確

10、定核酸樣品的純度，A260確定樣品的濃度,實驗動物的DNA免疫,6～8W 齡的BABC/c小鼠,,,空白質(zhì)粒pcDNA3.1+,重組質(zhì)粒pcDNA3.1+S,免疫前先用鹽酸布比卡因注射液預(yù)處理,,,,3天后,,相同部位進(jìn)行DNA接種,加強免疫一次，共免疫3次。,間隔2周,,,細(xì)胞因子的動態(tài)變化,常規(guī)方法分離脾細(xì)胞，濃度1×107,,24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入脾細(xì)胞懸液0.5ml，NP10?l(同時設(shè)空白對照孔， ConA刺激孔)

11、均設(shè)3個復(fù)孔,37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)48小時后,,收集脾細(xì)胞上清液，貯于-70℃，統(tǒng)一用ELISA kits 檢測IL-4和IFN-?,分別于免疫后5d, 10d, 17d, 35d,42d每組處死3只小鼠,淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng):,脾細(xì)胞取自初次免疫后42d的免疫鼠,,以重組的核蛋白刺激免疫小鼠的脾細(xì)胞,,陰性對照孔和陽性對照孔(ConA),用MTT法檢測脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)，計算刺激指數(shù)（SI）,常規(guī)方法分離脾細(xì)胞,濃度調(diào)整至2×

12、;106,免疫鼠血清的抗NP抗體的測定:,免疫前和免疫后5d, 10d, 17d, 35d,42d經(jīng)尾靜脈采血,,N=6/group,以被檢標(biāo)本復(fù)孔（3孔）OD值與免疫前血清（陰性對照）的比值≥2.1者為陽性。,重組的NP作為包被物，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗,ELISA法檢測血清的抗NP抗體,,血清抗NP抗體滴度的測定:,將初次免疫后42天的免疫鼠眼球取血,,N=6/group,留置血清，以10倍稀釋為起點,再做系列稀釋,

13、,ELISA法,檢測血清抗體滴度,六、核酸疫苗的優(yōu)化,1、免疫效果的優(yōu)化,選擇高效表達(dá)載體添加DNA免疫激活序列,,2、免疫途徑的優(yōu)化,肌肉注射（im）,基因槍導(dǎo)入,皮內(nèi)(id)和皮下(sc)注射,黏膜表面接種,,Effects of CpG motifs on various cells,Generation of Immunity after Inoculation of DNA Plasmid with GpG Motifs,,

14、2、免疫途徑的優(yōu)化,3、基因佐劑的應(yīng)用,細(xì)胞因子類共刺激分子分子佐劑聯(lián)合,,4、抗原蛋白的泛素化表達(dá),IL-12、IL-15、IL-18及IFN-γ以增強Th1型細(xì)胞應(yīng)答為主。 IL-4加強體液免疫,IL-2能同時加強體液免疫和細(xì)胞免疫 集落刺激因子,,5、與基因重組疫苗聯(lián)合應(yīng)用,,,,細(xì)胞因子產(chǎn)生的動態(tài)變化,,,,細(xì)胞因子產(chǎn)生的動態(tài)變化,,免疫鼠脾細(xì)胞的增殖反應(yīng),,血清特異性抗體的檢測結(jié)果,血清特異性抗體的檢測結(jié)果,,,,S

15、,,B7,,,免疫鼠脾細(xì)胞的增殖反應(yīng),,,,免疫鼠脾細(xì)胞的增殖反應(yīng),,血清的抗NP抗體的測定結(jié)果,血清的抗NP抗體的測定結(jié)果,七、核酸疫苗的安全性問題,①局部反應(yīng)原性和全身毒性研究，即考慮DNA疫苗是否有免疫毒性作用，機體是否對疫苗編碼的抗原產(chǎn)生耐受性，或是否導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)，還應(yīng)對疫苗中污染的細(xì)菌蛋白是否誘發(fā)抗體產(chǎn)生進(jìn)行評估；②遺傳性作用，即質(zhì)粒DNA是否與宿主基因組的整合問題；③生殖毒性研究，可采用PCR方法對經(jīng)質(zhì)粒DNA疫苗免

16、疫的雄性或雌性動物的性腺DNA提取物進(jìn)行檢測④致腫瘤性研究，如果質(zhì)粒DNA疫苗構(gòu)建具有與人的基因組同源的DNA序列，或其載體含有已知的潛在致癌基因序列時，需展開這方面的研究。,1、有關(guān)基因整合的研究,一個最重要的理論危機是質(zhì)粒DNA與宿主基因組整合的問題，因為當(dāng)外源DNA與基因組整合后，可能因插入活性癌基因、或活化宿主原癌基因、或使抑癌基因失活，或引起染色體斷裂，或染色體重排而致染色體不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞形成。,尚無證據(jù)證明以自身

17、表達(dá)質(zhì)粒的形式存在于染色體外的外源DNA能整合入宿主染色體中。 其整合發(fā)生率較自然整合發(fā)生率低3個數(shù)量級，另鮭魚精DNA已經(jīng)以一種非處方藥形式經(jīng)口服或注射等多種方式使用了數(shù)十年，卻未見任何明顯的副作用。,一些事實已清楚地證明脾內(nèi)或口服裸DNA可能導(dǎo)致整合,2、關(guān)于免疫耐受的研究,外源性抗原的持續(xù)表達(dá)可能產(chǎn)生不良后果：耐受性、自動免疫、過敏反應(yīng)、超免反應(yīng)等。 持續(xù)低表達(dá)---可被抗體中和清除， 無

18、足夠的免疫應(yīng)答。 持續(xù)高表達(dá)---超免反應(yīng)發(fā)生—免疫抑制 —其它病原感染。,,免疫2天的小鼠產(chǎn)生耐受 免疫出生24小時內(nèi)的小鼠，與在成年小鼠中觀察到的沒有區(qū)別。 HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行DNA免疫，使已經(jīng)建立的對HBsAg的特異性免疫耐受狀態(tài)被打破，使小鼠產(chǎn)生抗HBsAg的特異性抗體。,實驗結(jié)果：,結(jié)論：免疫耐受與抗原類型、濃度、給藥方式及宿主種屬、宿主年齡等因素有關(guān)。,3、關(guān)于自身免疫性疾病的

19、研究,潛在性誘導(dǎo)抗質(zhì)粒DNA的免疫反應(yīng)是另一個必須關(guān)注的安全性問題。,研究表明： 用細(xì)菌DNA與mBAS及CFA形成的復(fù)合體免疫小鼠，能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生與哺乳動物dsDNA發(fā)生反應(yīng)的IgG自身抗體。 用各種構(gòu)建的質(zhì)粒載體進(jìn)行的質(zhì)粒DNA的免疫并未發(fā)現(xiàn)抗DNA抗體的產(chǎn)生。 DNA疫苗接種有自身免疫傾向的小鼠，重復(fù)給藥并沒有啟動或加重具有狼瘡傾向個體的疾病發(fā)生及發(fā)展過程。,4、其它不良反應(yīng),進(jìn)行的Ⅰ期臨床試驗表明，未觀察到不可接受的不良反

20、應(yīng)。,八、DNA疫苗的應(yīng)用,（一）感染性疾病 （二）腫瘤 （三）自身免疫病與變態(tài)反應(yīng),表 病毒的DNA疫苗,表 病毒的DNA疫苗（續(xù)）,表 細(xì)菌的DNA疫苗,,表 寄生蟲的DNA疫苗,腫瘤抗原可被歸為四類：⑴ 個體腫瘤具有的獨特抗原⑵ 組織學(xué)相近腫瘤細(xì)胞具有的共同的抗原⑶ 組織分化抗原⑷ 正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均表達(dá)的抗原,DNA疫苗應(yīng)用于腫瘤 DNA疫苗 腫瘤

21、 B細(xì)胞獨特型 淋巴瘤 Gp75/酪氨酸相關(guān)蛋白－1 黑色素瘤 MAGE,MART 黑色素瘤 前列腺表面抗原 前列腺癌 突變P53基因 P53基因突變引起的 腫瘤,,,,傳統(tǒng)免疫方法用于變態(tài)反應(yīng)性疾病治療的特點:重復(fù)注射、劑量逐漸增加誘導(dǎo)IgG型封閉抗體引起變態(tài)

22、反應(yīng)的危險療效不穩(wěn)定費用高、時間長被藥替代,DNA疫苗用于變態(tài)反應(yīng)性疾病治療的特點： 主要誘導(dǎo)IgG2a抗體 可中和變應(yīng)原 誘導(dǎo)較強的Th1應(yīng)答 抑制抗原特異性IgE合成 和嗜酸性粒細(xì)胞的活化 不會引起變態(tài)反應(yīng)

23、抑制炎癥反應(yīng),自身免疫病(多發(fā)性硬腫癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Ⅰ型糖尿病),對微生物應(yīng)答降低,針對自身組織T細(xì)胞活化,抗前炎癥介質(zhì)抗體（少量),前炎癥介質(zhì)（細(xì)胞因子、趨化因子）,產(chǎn)生量增加,炎癥，組織損傷,中和效應(yīng),炎癥反應(yīng)、組織損傷減輕,DNA疫苗,,,,,,,,,,,有待進(jìn)一步研究的問題： ◆ DNA疫苗目的基因的選擇 ◆ 目的基因的高效表達(dá) ◆ 優(yōu)良載體的構(gòu)建 ◆ 誘導(dǎo)適當(dāng)免疫應(yīng)答（個體中差異