核酸分子雜交技術(shù)ppt課件

1、核酸分子雜交技術(shù),李如波中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院,核酸分子雜交技術(shù)(Nucleic acid molecular hybridization)是檢測(cè)核酸分子間序列同源性的一種技術(shù)。不同來(lái)源的核酸單鏈只要彼此間有一定的互補(bǔ)序列，即可按堿基配對(duì)規(guī)則以氫鍵相結(jié)合。通常是先對(duì)一種核酸進(jìn)行標(biāo)記（如放射性同位素35S，32P或生物素等）作為探針，去探測(cè)另一種核酸序列。核酸分子雜交可以在DNA與DNA，RNA與RNA，或DNA與RNA之間進(jìn)行。由于這種

2、技術(shù)具有高度的特異性和靈敏性，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)科學(xué)研究，臨床傳染病和遺傳病的診斷。,一、核酸分子雜交的基本原理 從化學(xué)和生物學(xué)意義上理解，探針(Probe)是一種分子，它帶有供反應(yīng)后檢測(cè)的合適標(biāo)記物，并僅與特異靶分子反應(yīng)?？乖?抗體、外源凝集素-碳水化合物、親和素-生物素、受體-配體(ligand)以及互補(bǔ)核酸間的雜交均屬于探針-靶分子反應(yīng)。蛋白質(zhì)探針（如抗體）與特異靶分子是通過(guò)混合力（疏水、離子和氫鍵）的作用

3、在少數(shù)特異位點(diǎn)上的結(jié)合，而核酸探針與互補(bǔ)鏈的反應(yīng)則是根據(jù)雜交體的長(zhǎng)短不同，通過(guò)氫鍵在幾十、幾百甚至上千位點(diǎn)上的結(jié)合。核苷酸經(jīng)某一原子、功能基團(tuán)或長(zhǎng)側(cè)鏈修飾后仍有可能進(jìn)行堿基配對(duì)，這取決于修飾的部位和修飾物的性質(zhì)。標(biāo)記的探針每1kb只摻入10-30個(gè)修飾堿基，僅4％-12％的單個(gè)堿基被修飾的類似物取代了。盡管摻入位點(diǎn)外的堿基配對(duì)較弱或不存在，但對(duì)整個(gè)雜交分子的穩(wěn)定性影響很小。,原位雜交原理示意圖,二、核酸探針的種類根據(jù)標(biāo)記方法不同可分為

4、： 放射性探針； 非放射性探針兩大類，根據(jù)核酸的性質(zhì)不同又可分為： DNA探針 RNA探針 cDNA探針 cRNA探針 DNA探針還有單鏈(ssDNA)和雙鏈(dsDNA)之分。所以原位雜交可分為DNA-DNA，cDNA-RNA，RNA-RNA和寡核苷酸與DNA或RNA等雜交方式。,三、核酸探針的標(biāo)記和檢測(cè) 最早采用也是目前最常用的核酸標(biāo)記方法是

5、放射性同位素標(biāo)記，常用的放射性同位素有32P和35S，前者能量高，信號(hào)強(qiáng)，最常用。放射性同位素探針雖然靈敏性高，但卻存在輻射危害和半衰期限制。由于存在上述缺點(diǎn)，近年來(lái)，人們?cè)趯で蠓欠派湫詷?biāo)記物方面取得了很大進(jìn)展。國(guó)際上已有多家公司相繼推出多種非放射性探針標(biāo)記試劑盒，在國(guó)內(nèi)也具備生物素類標(biāo)記物的生產(chǎn)能力，并有相應(yīng)試劑出售。目前非放射性標(biāo)記物有以下幾類：金屬如Hg；熒光物質(zhì)如FITC；半抗原如地高辛（DIG）；生物素；酶類如辣根過(guò)氧化物酶（

6、HRP）；半乳糖苷酶或堿性磷酸酶（AKP）等。,四、核酸標(biāo)記方法及其顯示方法（一）核酸探針的放射性標(biāo)記技術(shù)1. 缺口平移標(biāo)記方法 其原理是首先用DNA酶在雙鏈DNA探針的一條鏈上制造一個(gè)缺口（nick），缺口處形成3’-羥基末端，在大腸桿菌DNA聚合酶I的催化下將核苷酸殘基加在3’-羥基本上。同時(shí)根據(jù)大腸桿菌DNA聚合酶I的5’→3’ 核酸外切酶活性，此酶將缺口5’端核苷酸依次切除，其結(jié)果是在缺口的5’端不斷消除核

7、苷酸而在3’端則依次添加核苷酸，從而使缺口沿著互補(bǔ)DNA鏈移動(dòng)，故稱缺口平移（nick transcription）。根據(jù)這個(gè)原理，用α-32P dATP置換先前存在的核苷酸，則可制備高活性的DNA探針，能滿足大多數(shù)雜交的要求。,圖9－1 利用E. coli DNA聚合酶的切口平移反應(yīng)用 DNase I 處理可將單鏈切口引入DNA。大腸桿菌DNA聚合酶I（Pol I）則結(jié)合到雙鏈DNA的切口或缺口處，Pol I的5’→3’外切核酸酶活

8、性可將DNA一條鏈的核苷酸除去，產(chǎn)生同時(shí)合成DNA延伸鏈的模板。然后，沿著DNA分子，通過(guò)5’→3’外切核酸酶和5’→3’聚合酶的聯(lián)合作用，最初的切口被翻譯。如圖所示，通過(guò)DNA聚合酶的作用，在dNTP存在的情況下，反應(yīng)中雙鏈DNA的上一條鏈的切口從左到右被翻譯。雙鏈DNA的下一條鏈中，切口平移為從右到左進(jìn)行。波浪形箭頭代表新合成DNA鏈的片段。,2. DNA快速核酸標(biāo)記 大腸桿菌聚合酶I經(jīng)枯草桿菌酶切割可得到兩條多

9、肽鏈，其中分子量為76kD的大片斷稱為Klenow片段。該酶具有完整聚合酶I的5’→3’ 核酸聚合酶活性和3’→5’ 核酸外切酶活性，但缺乏5’→3’ 核酸外切酶活性。利用Klenow片段可以填補(bǔ)由限制性酶消解DNA所產(chǎn)生的3’凹陷末端。因此，用這種方法可以標(biāo)記雙鏈DNA的凹陷3’末端。用Klenow片段標(biāo)記末端一般只用一種[α-32P] dNTP，加入反應(yīng)的[α-32P] dNTP取決于延伸的5’末端序列。,3. 用T4多核苷酸激酶標(biāo)

10、記DNA5’末端 寡核苷酸探針或短的RNA和DNA探針可選用此方法。T4多核苷酸激酶(polynucleotide kinase, PNK)是由T4噬菌體感染的大腸桿菌中提取的，此酶能催化ATP的γ-磷酸轉(zhuǎn)移至DNA或RNA的5’-OH末端。在過(guò)量ADP存在時(shí)，也可促進(jìn)磷酸交換反應(yīng)，使PNK將DNA末端5’磷酸轉(zhuǎn)移到5ADP上生成ATP，然后催化[α-32P] dNTP上的標(biāo)記磷酸轉(zhuǎn)移至DNA的5’末端，從而使DNA重新

11、磷酸化，并得到標(biāo)記。注意要用堿性磷酸酶去掉磷酸基團(tuán)。,4. 隨機(jī)引物延伸標(biāo)記方法是從單鏈DNA或RNA模板合成高比活性的32P標(biāo)記探針?biāo)x用的方法。原理是使長(zhǎng)6-8nt的寡核苷酸片段與變性的DNA或RNA模板退火，在DNA聚合酶I的作用下，以每一個(gè)退火到模板上的寡核苷酸片段為引物引發(fā)DNA鏈的合成，在反應(yīng)時(shí)將α-32P dNTP摻入合成鏈，即得到標(biāo)記。變性處理后，新合成鏈（探針片段）與模板解離，即得到無(wú)數(shù)各種大小的探針DNA。因?yàn)樗?/p>

12、真核苷酸片段很短，在低溫條件下可與模板DNA隨機(jī)發(fā)生退火反應(yīng)，因此，被稱為隨機(jī)引物(random primer)。這種隨機(jī)引物可用小牛胸腺DNA或魚(yú)精DNA制備。,5. 聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)是一種分子生物學(xué)新技術(shù)，由于美國(guó)Cetus公司人類遺傳學(xué)部的Kary B. Mulli于1985年創(chuàng)立。該技術(shù)利用兩個(gè)與相反鏈雜交并隨著于靶DNA兩側(cè)的寡核苷酸

13、引物經(jīng)酶促合成特異的DNA片斷，包括膜板變性、引物退火和引物延伸三個(gè)步驟的反復(fù)循環(huán)，最終兩引物所夾靶DNA得到千萬(wàn)倍以上的擴(kuò)增。可用來(lái)標(biāo)記高比活性的DNA探針，PCR技術(shù)有很高的特異性，可以在1-2小時(shí)內(nèi)大量合成探針DNA片斷。如果在底物中加入[α-32P] dNTP或其它標(biāo)記的dNTP，則探針DNA合成過(guò)程中可得到很好的標(biāo)記，標(biāo)記物摻入率可高達(dá)70％-80％。PCR標(biāo)記技術(shù)特別適用于大規(guī)模檢測(cè)和非放射性標(biāo)記。該法的特點(diǎn)是要合成一對(duì)特異

14、性PCR引物。,6. 體外轉(zhuǎn)錄法 先把DNA片段克隆到有噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的載體中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA為模板，以含有標(biāo)記的三磷酸核糖核苷為原料，對(duì)啟動(dòng)子下游的序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，所謂啟動(dòng)子(promotor)，又稱啟動(dòng)基因，是入出境DNA分子上可與RNA聚合酶特異性結(jié)合而使轉(zhuǎn)錄開(kāi)始的部位，而啟動(dòng)子本身并不被轉(zhuǎn)錄。 體外轉(zhuǎn)錄常用的噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子有沙門(mén)氏菌噬菌體SP6和大腸桿菌噬菌體T3，T7。當(dāng)

15、二個(gè)不同的噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子結(jié)合在載體多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)，而且互相呈相對(duì)方向時(shí)，則可分別啟動(dòng)插入DNA片段Sense和Antisense的轉(zhuǎn)錄。 轉(zhuǎn)錄前要用限制酶先在cDNA插入點(diǎn)的下游切割，使DNA直線化，做為模板，以標(biāo)記的三磷酸核糖核苷為原料，轉(zhuǎn)錄合成RNA探針。,（二）核酸探針的非放射性標(biāo)記技術(shù)1. 光敏生物素標(biāo)記核酸 有二種光敏生物素：均由一個(gè)光敏基團(tuán)、一個(gè)鏈接臂和一個(gè)生物素基團(tuán)組成。光生物素：光

16、敏基團(tuán)是-N3，在光作用下可與核酸中的堿基結(jié)合。補(bǔ)骨脂素生物素：光敏基團(tuán)是補(bǔ)骨脂素，在光照（320-400μm）下，可與單鏈或雙鏈DNA發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)主要在T上，C上也有一定程度的反應(yīng)。 光敏生物素的連接臂含有6-12個(gè)碳原子，用以減少探針雜交時(shí)的空間位阻。此方法簡(jiǎn)單，靈敏度可達(dá)ng水平 ，可用于外源基因的檢測(cè)。,2. 酶促生物標(biāo)記核酸 以生物素化的脫氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP, Bio-7

17、-dATP, Bio-11-dCTP）等代替相應(yīng)32P標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸，以DNA聚合酶作用摻入DNA。Bio-dUTP代替dTTP，Bio-dATP代替dATP，Bio-CTP代替dCTP。Bio-11-dUTP的11是指生物素基團(tuán)與脫氧核苷酸之間連接臂的碳鏈長(zhǎng)度。常用的酶促生物標(biāo)記DNA的方法有缺口平移法和隨機(jī)引物延伸法。,3. 寡核苷酸的生物素末端標(biāo)記5’-磷酸的化學(xué)標(biāo)記法： 將寡苷酸的5’-磷酸接上一個(gè)乙二

18、胺，然后用琥珀亞胺生物素，將生物素基團(tuán)連接到磷酸酰胺基上。3’-OH的酶捉標(biāo)記法： 用末端轉(zhuǎn)移酶將Bio-11-dUTP加于其3’-OH端，脫去一個(gè)焦磷酸。4. 酶標(biāo)DNA標(biāo)記試劑：辣根過(guò)氧化物酶（HRP）；堿性磷酸酶（AP） 通過(guò)對(duì)苯醌（PBQ）與聚乙烯亞胺（PEI）連接而成（HRP-PBQ-PEI+），此試劑在戊二醛的作用下與變性的DNA結(jié)合，使HRP與DNA連接在一起，組成HRP標(biāo)記的DNA探針

19、。,5. 酶標(biāo)寡核苷酸核苷酸5’-末端標(biāo)記HRP法： 在HRP中產(chǎn)生一個(gè)-SH反應(yīng)基團(tuán)，在寡苷酸合成終了加在5’-端，帶一個(gè)C6的-HS，與活化的HRP反應(yīng)生成5’-HRP寡苷酸。內(nèi)中標(biāo)記AP法： 在合成寡核苷酸過(guò)程中將一個(gè)5’帶連接臂及CF3基團(tuán)的尿苷3’亞磷酰亞胺合成在寡核苷酸鏈中，合成后此活化的寡核苷酸與AP即得到AP標(biāo)記的寡核苷酸。6. DNA半抗原標(biāo)記 其原理與Bio-11

20、-dUTP相同 ，只是用毛地黃甙抗體檢測(cè)標(biāo)記在DNA上的半抗原分子地高辛（Digoxigenin，DIG）。,（三）非放射性探針的顯示體系1. AP顯色體系A(chǔ)SO-AP+BCIP→BCI-OH+PiBCI-OH+NBT→紫色ASO：等位基因特異的寡核苷酸BCIP：5溴-4氯-3吲哚磷酸NBT：四氮唑藍(lán)Pi：磷酸2. HRP顯色體系HRP+H2O2→[HRP?H2O2]ODA-NH2+[HRP?H2O2] →ODA-N

21、=ODA/棕色↓ +HRP+H2OODA；鄰-聯(lián)茴香胺,3. ABC顯色體系DNA-B+SA-AP→DNA-B-SA或DNA-B+SA+BAP→DNA-B-SA-BAPSA：streptavidin(鏈霉親合素)BAP：生物素化的磷酸酶B：biotin(生物素), ABC:avidin-botin-enzyme complex(親合素-生物素-酶復(fù)合物)。4.非放射發(fā)光身顯影若將AP或HRP的顯色底物根據(jù)光化學(xué)原理?yè)Q成一

22、種酶解后產(chǎn)生的光子的化合物，可用自顯影技術(shù)曝光X線片顯示。,HRP發(fā)光自顯影：氨基苯-甲酰肼在HRP與H2O2作用下氧化為氨基苯二甲酸，同時(shí)放出N2及發(fā)光。AP發(fā)光自顯影：發(fā)光底物金剛烷二氧丁環(huán)磷酸鹽（AMPDD），其磷酸二脂鍵在AP作用下水解一個(gè)磷酸，進(jìn)而由分子內(nèi)過(guò)氧鍵提供能源分解并產(chǎn)生金剛酮和激發(fā)態(tài)的甲基間-氧苯甲酸陰離子，恢復(fù)到基態(tài)時(shí)發(fā)光。,五、核酸分子雜交方法和類型（一）、固相膜核酸分子雜交 將參加反應(yīng)的

23、一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸游離在溶液中，固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒，磁珠和微孔板等。雜交后未雜交的游離片斷容易洗去，膜上留下的雜交物容易檢測(cè)能防止和DNA自我復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，故該法最為常用。其類型有：菌落原位雜交、斑點(diǎn)雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、細(xì)胞或組織原位雜交和夾心雜交等。,方法：1. DNA變性：變性能使DNA雙鏈解開(kāi)，常用SSC（0.1mol/L SSC,

24、 15mmol NaCl-1.5mmol 檸檬酸三鈉）堿變性。2. 膜上固定： 20×SSC中轉(zhuǎn)膜-毛細(xì)現(xiàn)象，固定，80℃下，2小時(shí)或紫外線下1分鐘（Cross link）。3. 預(yù)雜交：塑料袋中預(yù)熱60℃，預(yù)雜交液中：6×SSC，0.01molEDTA，5×Denhardt氏液，0.5％SDS，100 μg/ml變性鮭魚(yú)精DNA4. 雜交：雜交液中的組成：6×SSC，0.01molEDTA

25、，5×Denhardt氏液，0.5％SDS，100 μg/ml變性鮭魚(yú)精DNA及探針。5. 洗膜：2×SSC-0.5％SDS， 0.1×SSC-0.5％SDS，60℃ 2小時(shí)。6. 顯色：放射自顯影；感光顯影。,種類：A：菌落原位雜交(Colony in situ hybridization)：是將細(xì)菌從培養(yǎng)平板中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后再將濾膜上的菌落裂解以釋放出DNA。將DNA烘干固定膜上與標(biāo)記

26、的探針雜交，放射自顯影，檢測(cè)雜交信號(hào)，與平板上的菌落對(duì)位。B：斑點(diǎn)雜交(Dot blot)：是將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定，簡(jiǎn)便，快速，可做半定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。,C： Southern 印跡雜交(Southern blot)：將DNA標(biāo)本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電脈分離各酶解片斷，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和（及）高鹽下通過(guò)毛細(xì)作用，將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維濾膜上，烘干后即可用于雜交。雜交后放射

27、自顯影顯示與探針互補(bǔ)的DNA酶解片斷。是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)生分析生平方面有重要價(jià)值。D：Northern印跡雜交(Northern blot)：是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上的方法。轉(zhuǎn)印方法與DNA相似，但是在進(jìn)樣前用甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因?yàn)闀?huì)水解RNA的2’-羥基團(tuán)。,E：組織原位雜交：簡(jiǎn)稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，組織或細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)?shù)奶幚砗笫辜?xì)胞通透

28、性增加，讓探針進(jìn)行細(xì)胞與DNA或RNA雜交，因此可以確定探針的互補(bǔ)序列在細(xì)胞內(nèi)的空間定位，具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。染色體DNA雜交可顯示特定序列在染色體上的定位，與RNA雜交或顯示特定RNA在細(xì)胞中或組織中的定位。探針可以是雙鏈或單鏈DNA，也可是RNA探針。長(zhǎng)度以100-400nt為宜。寡核苷酸探針（16-30nt）能自由地出入細(xì)胞和組織細(xì)胞壁，雜交效率明顯高于長(zhǎng)探針，是優(yōu)選探針。,（二）、液相雜交 參加反應(yīng)的

29、兩條核酸鏈都在溶液中，是一種最早且操作簡(jiǎn)便的雜交類型，雖有時(shí)被應(yīng)用，但不如固相雜交普遍，其原因是雜交后的過(guò)量未雜交探針在溶液中去除較為困難和誤差較高。近來(lái)有商業(yè)性基因探針診斷盒的應(yīng)用。,原位核酸分子雜交技術(shù),原位核酸分子雜交技術(shù)簡(jiǎn)稱原位雜交(in situ hybridization)，是應(yīng)用已知堿基順序并帶有標(biāo)記物的核酸探針與組織、細(xì)胞中待檢測(cè)的核酸按堿基配對(duì)的原則進(jìn)行特異性結(jié)合而形成雜交體，然后再應(yīng)用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)組織

30、化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在被檢測(cè)的原位形成帶顏色的雜交信號(hào)， 在顯微鏡或電子顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。這一技術(shù)為研究單一細(xì)胞中DNA和編碼各種蛋白質(zhì)、多肽的相應(yīng)mRNA的定位提供了手段。使從分子水平研究細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)及有關(guān)基因調(diào)控提供了有效的工具，視為組織化學(xué)或免疫細(xì)胞化學(xué)中革命性的突破。,原位雜交技術(shù)已應(yīng)用于基礎(chǔ)研究如基因組圖(gene mapping)，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，基因表達(dá)定位(localization of gene expressio

31、n) ,核DNA和RNA的mRNA的排列和運(yùn)輸(arrangement and transport of mRNA)，復(fù)制(replication)和細(xì)胞的分類(sorting of cells)。臨床應(yīng)用在細(xì)胞遺傳學(xué)(cytogenetics)，產(chǎn)前診斷(prenatal diagnosis)，腫瘤和傳染性疾病的診斷，生物學(xué)劑量測(cè)定(biological dosimetry)和病毒學(xué)的病源學(xué)診斷等。,一、原位核酸分子雜交技術(shù)的發(fā)展

32、 原位雜交1969年由美國(guó)耶魯大學(xué)Gall和Pardue首先創(chuàng)立的，他們用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，確定該基因定位于卵母細(xì)胞的核仁中。與此同時(shí)，Buogiorno-Nardelli和Amaldi，John及其同事等相繼利用同位素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行了細(xì)胞或組織的基因定位。Ortho（1970）應(yīng)用3H標(biāo)記的兔乳頭狀瘤病毒cDNA探針在兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進(jìn)行雜交，首次用原位雜交技術(shù)檢出了病毒DNA在細(xì)胞中的定位

33、。,由于同位素標(biāo)記探針具有放射性，既污染環(huán)境，又對(duì)人體有害，且受半衰期限制等缺點(diǎn)，因此研究用非放射性標(biāo)記物標(biāo)記核酸探針進(jìn)行原位雜交，引起許多學(xué)者的重視和探索。Bauman（1981）等首先用熒光素標(biāo)記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得了成功。Shroyer(1982)報(bào)導(dǎo)用2，4二硝基苯甲醛（DNP）標(biāo)記DNA，使該DNA探針具有抗原性，然后用兔抗DNP的酶標(biāo)抗體來(lái)識(shí)別雜交后探針，最后經(jīng)免疫過(guò)氧化物酶組織化學(xué)的方法顯示雜交

34、信號(hào)。,Brigat(1983)首先創(chuàng)立生物素標(biāo)記的探針在組織切片上檢出了病毒DNA，通過(guò)生物素與抗生物素結(jié)合，過(guò)氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒DNA在細(xì)胞中的定位，生物素標(biāo)記探針技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用，特別是在病毒學(xué)和病理學(xué)診斷中。 Boeringer-Mannhem Biochemisca (Roche)于1987年將地高辛標(biāo)記的有關(guān)試劑和藥盒投放市場(chǎng)，和其它非放射性標(biāo)記物一樣，地高辛較放射性標(biāo)記系統(tǒng)安全，方便、省時(shí)。同時(shí)在

35、敏感性和質(zhì)量控制方面比生物素標(biāo)記要優(yōu)越，地高辛標(biāo)記法顯示的顏色為藍(lán)色（標(biāo)記堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)），有較好反差背景，更有利于與免疫組織化學(xué)相結(jié)合，同時(shí)可以檢測(cè)基因表達(dá)。,二、 原位分子雜交技術(shù)的基本方法基本方法包括：雜交前準(zhǔn)備：包括固定、取材、玻片和組織的處理，增強(qiáng)核酸探針的穿通性和減低背景染色等；2. 雜交；3. 雜交后處理；4. 顯示：包括放射性自顯影和非放射性標(biāo)記的組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)顯色。,（一）、固定

36、 固定的目的是為了保持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，最大限度地保存細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA的水平；使探針容易進(jìn)入細(xì)胞或組織。DNA比較穩(wěn)定，mRNA易被酶降解。所以取材后應(yīng)盡快冰凍或固定。1. 最常用多聚甲醛固定液，因其不會(huì)與廣泛的交叉連接，不會(huì)影響探針穿透入細(xì)胞或組織。2. mRNA原位雜交時(shí)應(yīng)將組織固定于4％多聚甲醛磷酸緩沖液中1-2h，在冰凍前浸入15％蔗糖中4℃過(guò)夜，次日切片或保存于液氮中。,3. 組織也可在取材后直接置于液

37、氮中冷凍，切片后將其浸入4％多聚甲醛約10min空氣中干燥后保存于-70℃，可保存數(shù)月。4. 福爾馬林固定、石蠟包埋的切片對(duì)檢測(cè)DNA或mRNA有時(shí)也可獲得雜交信號(hào)，但由于與蛋白質(zhì)交聯(lián)的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號(hào)常低于冰凍切片。同時(shí)在包埋的過(guò)程中可減低mRNA的含量。,（二）、玻片和組織切片的處理1. 玻片的處理：洗滌劑浸泡，清水沖洗；弱酸中浸泡，沖洗；酒精中浸泡，沖洗，最后蒸餾水沖洗，烘干，高熱滅菌。粘附劑涂片：有三種

38、： 鉻礬-明膠液； 多聚賴氨酸（Poly－L－Lysine） ； APES(3-amino propyltriethoxy salane，氨丙基三乙氧基硅烷)。 一般2％APES丙酮液中浸泡10秒，然后丙酮中洗1分鐘。,2. 增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性常用的方法：應(yīng)用稀釋的酸洗滌；去垢劑(detergent)或稱清洗劑，如Triton-X 100或某些消化酶，如蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白

39、酶、膠原蛋白酶和淀粉酶(diastase)等。注意不要過(guò)度。蛋白酶K(proteinase K)的消化作用的濃度及孵時(shí)間視組織種類、應(yīng)用固定劑的種類、切片的厚薄而定。一般應(yīng)用1μg/ml（于0.1mol/L Tris-50mmol/L EDTA，pH8.0中）， 在37℃下孵育15-20分鐘。,3. 減低背景染色：雜交后的酶處理和洗滌均有助于減低背景顏色。在多聚甲醛固定后浸入乙酸酐(acetic anhydride)和三乙醇胺(trie

40、thanolamine)中以減低靜電效應(yīng)，減少探針對(duì)組織的非特異性背景染色。預(yù)雜交是減低背景染色的一種有效手段，預(yù)雜交液與雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖(dextran sulphate)，可達(dá)到封閉非特異性的雜交目的，減低背景染色。在雜交后洗滌中用低濃度的RNA酶溶液（201μg/ml）洗滌一次，以減低殘留的內(nèi)源性的RNA，減低背景染色。4. 防止RNA酶的污染：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程戴消毒手套，器具高溫消毒（240℃）。溶液配制用

41、DEPC水。,（三）、雜交： 雜交(hybridization)是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片，或用無(wú)菌的蠟?zāi)ご婀杌纳w玻片，防止孵育過(guò)程中雜交液的蒸發(fā)。切片放于5×SSC或 2×SSC溶液的濕盒中進(jìn)行孵育。SSC：(standard saline citrate)（四）、雜交后處理：不同溫度，不同鹽濃度的漂洗。一般的原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由高到低。注意漂洗過(guò)程中切勿干燥。（

42、五）、顯示（檢測(cè)系統(tǒng)）前述,（六）、對(duì)照實(shí)驗(yàn)和結(jié)果的判定1. 將cDNA與cRNA探針進(jìn)行雜交（吸收實(shí)驗(yàn)）2. 與非特異性（載體）序列和不相關(guān)探針雜交（置換實(shí)驗(yàn)）3. 將切片用RNA酶或DNA酶進(jìn)行預(yù)處理后進(jìn)行雜交，用同義探針(sense probe)進(jìn)行雜交。4. 以不中核酸探針雜交液進(jìn)行雜交（空白實(shí)驗(yàn)）。5. 組織對(duì)照用已知確定為陽(yáng)性或陰性組織進(jìn)行雜交對(duì)照。6. 用未標(biāo)記探針雜交，進(jìn)行對(duì)照。,三、 RNA原位核酸雜交方法

43、（一）、基本原理 是指運(yùn)用cRNA或寡核苷酸等探針檢測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)RNA表達(dá)的一種原位雜交技術(shù)?；驹硗笆雠cDNA雜交區(qū)別：1. 探針不同，避免了應(yīng)用雙鏈DNA探針在雜交反應(yīng)中兩條鏈的復(fù)性與第二條鏈竟?fàn)幮噪s交；RNA雜交體穩(wěn)定，雜交后RNA酶洗脫，特異性強(qiáng)。2. 檢測(cè)目的不同：內(nèi)源性基因如細(xì)胞內(nèi)固有基因、異?；蚝妥儺惢蚝屯庠葱曰颍缂?xì)菌或病毒 3. 有較高的靈敏度。,不足之處：1. 不同種類探針的

44、選擇、制備和標(biāo)記要適合靶核酸和組織的特點(diǎn)；2. 有效制止組織和細(xì)胞內(nèi)RNA降解；3. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)防RNA酶污染；4. 對(duì)雜交信號(hào)有效的放大和技巧；5. 陽(yáng)性結(jié)果的判定，不僅要有陽(yáng)性或陰性標(biāo)本對(duì)照，有條件的還觀察Northern雜交和免疫組織化學(xué)對(duì)同一組織的冰凍切片或石蠟切片中，基因及其產(chǎn)物兩者表達(dá)之間關(guān)系；6. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中熟練運(yùn)用技術(shù)是雜交成功的關(guān)鍵。,（二）、RNA探針?lè)N類：1. cRNA探針：是以cDNA為模板，通過(guò)

45、體外轉(zhuǎn)錄獲得。2. 寡核苷酸探針：以核苷酸為原料，通過(guò)DNA合成儀合成。標(biāo)記：1. 酶反應(yīng)法：末端標(biāo)記法，將標(biāo)記物導(dǎo)入線型DNA或RNA的5’端或3’端的一種標(biāo)記法，一般攜帶的標(biāo)記分子較少。,2. 體外轉(zhuǎn)錄法：是一種與克隆片段序列相同的單RNA探針的方法。先將靶核苷酸序列克隆到含噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的載體中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA為模板， 以含有標(biāo)記的三磷酸苷為原料，對(duì)啟動(dòng)子下游的序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，而啟動(dòng)子本身并不轉(zhuǎn)錄。如大

46、腸村菌噬菌體T3，T7，SP6。當(dāng)兩個(gè)不同的噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子結(jié)合在多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶在插入序列的下游將持粒線性化，在4 種三磷酸核糖核苷的相應(yīng)的噬菌體RNA聚合酶的存在下，即轉(zhuǎn)錄成RNA。如反應(yīng)物中有標(biāo)記的三磷酸核糖核苷，所有的RNA易被標(biāo)記。常用的非放射性標(biāo)記技術(shù)有：生物素、地高辛（DIG）、堿性磷酸酶（AP）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和熒光素。,圖9-2 用噬菌體編碼的RNA聚合酶體外合成RNA將待轉(zhuǎn)錄的DNA

47、片段克隆入多克隆位點(diǎn)區(qū)的限制性位點(diǎn)中，多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)帶有兩個(gè)噬菌體聚合酶啟動(dòng)子（通常為T(mén)7和SP6）。用可切割轉(zhuǎn)錄區(qū)下游的限制性內(nèi)切核酸酶酶切使DNA線性化，以防止環(huán)狀模板DNA多聚轉(zhuǎn)錄物的合成。將適當(dāng)?shù)木酆厦讣皉NTP加入適宜的緩沖液時(shí)，即可從靠近插入物的啟動(dòng)子開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。互補(bǔ)于一條模板鏈的RNA產(chǎn)物的長(zhǎng)度與轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子及線性DNA至靶序列末端之間的距離相等。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，用無(wú)RNA酶的DNA酶消化除去DNA模板，DNA酶消化后產(chǎn)生的未

48、摻入的核苷酸和寡脫氧核著酸可通過(guò) Sephadex G-75層析除去。,純化：為了去除在探針標(biāo)記過(guò)程中未被標(biāo)記的剩余dNTP等小分子，常用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法進(jìn)行純化。 1. 乙醇沉淀法的原理：DNA可被乙醇沉淀，而未摻入DNA的dNTP則保留在上清中，由些反復(fù)乙醇沉淀能將兩者分開(kāi)。 2. 酚/氯仿抽提法：交替使用酚、氯仿這兩種不同的蛋白質(zhì)變性劑，能將溶液中的蛋白質(zhì)除去。,水解：RNA探針的長(zhǎng)度以5

49、0-150堿基為佳，探針易進(jìn)行入細(xì)胞，雜交率高，雜交時(shí)間短。合成長(zhǎng)的探針需要水解成短的探針。試劑：40mM NaHCO3+60mM Na2CO37M NH4OAc+EtoH時(shí)間：溫度：60℃ Lf - LoT = ─────── K ? Lf ? LoK= 0.11 kb/minLf: 原檢測(cè)基因的長(zhǎng)度（已合成的探針的長(zhǎng)度）kbLo: 要水解的探針的長(zhǎng)度 kb,BCL-

50、2 ISH Detection KitBCL－2原位雜交檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)產(chǎn)品編號(hào)：HK1050 保存：置4℃工作量：100張切片 有效期：一年 BCL-2是主要的抗凋亡基因。本試劑盒采用針對(duì)人、大鼠、小鼠的BCL-2特異性寡核苷酸探針，經(jīng)地高辛標(biāo)記。由于采用多相寡核苷酸探針和高敏感標(biāo)記技術(shù)，并配合使用敏感性加強(qiáng)型的原位檢測(cè)方法，具有敏感性特別高，背景清晰，結(jié)果準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)。可以檢測(cè)出常規(guī)福爾馬林固定

51、，石蠟包埋標(biāo)本的BCL-2 mRNA序列。,針對(duì)人的BCL-2的寡核苷酸探針序列：5’TGCGA CAGCT TATAA TGGAT GTACT TCATC3’；5’GTGAA GGGCG TCAGG TGCAG CTGGC TGGAC3’；5’AGGTG CCGGT TCAGG TACTC AGTCA TCCAC3’。 上述序列和大鼠、小鼠的序列僅3bp/90bp不同。兔和人序列基本相同。適用種屬: 人、大鼠、

52、免、小鼠組織。,試劑盒中內(nèi)容：胃蛋白酶（×10；Pepsin）2ml；2. 預(yù)雜交液2ml；3. BCL-2寡核苷酸探針雜交液 2ml；4. 封閉液5ml；5. 生物素化鼠抗地高辛5ml；6. SABC-POD 5ml；7. 生物素化過(guò)氧化物酶5ml。用戶自備試劑：原位雜交專用蓋玻片（博士德有售）：POLY－L－LYSINE；DEPC；20%甘油緩沖液（3%檸檬酸，1×SSC，0.5

53、15;SSC, 0.2×SSC, 0.5M PBS）,一、培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片準(zhǔn)備工作：緩沖液的配備3％檸檬酸：100ml蒸餾水中加檸檬酸（C6H8O7?H2O）3g，pH 2.0左右。2×SSC：1000ml蒸餾水中加氫化鈉17.6g，檸檬酸三鈉（C6H5O7Na3?2H2O，分子量294）8.8g。0.5×SSC：300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。0.2×SSC：

54、270ml蒸餾水加30ml 3×SSC即可。20％甘油：20ml甘油加80ml蒸餾水即可。0.5M PBS：1000ml蒸餾水加氯化鈉30g，Na2HPO4?12H2O 6g，NaH2PO4?2H2O 0.4g，pH7.2-7.6。,操作程序：注意：最重要的是及時(shí)固定，并在固定液中加入0.1％的DEPC處理，以抑制RNA酶對(duì)mRNA的分解作用。此外，過(guò)度固定對(duì)原位雜交有明顯的不利影響。1. 玻片的處理： 一般采用多聚賴氨

55、酸或APES。切片厚度20μm。2. 細(xì)胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，條件為37℃和5％的CO2，所用培養(yǎng)基為Dubecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細(xì)胞長(zhǎng)好后0.1M PBS（pH 7.4）洗2分鐘×3次。3. 培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4％多聚甲醛／0.1M PBS（pH 7.2-7.4），含有1／1000 DEPC。室溫固定 30-60分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。,4. 新鮮

56、配制0.5％H2O2／甲醇室溫處理30分鐘以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。蒸餾水洗滌3次。5. 暴露mRNA核酸片段：切片上摘加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶（1ml 3%檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻），37℃消化30-120秒鐘。有時(shí)也可以不消化。0.5M PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。6. 預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備：干的雜交盒底部加20％甘油20ml以保持濕度。按每張切片加20 μl預(yù)雜交液。恒溫箱37-40℃ 24小時(shí)。

57、吸取多余液體，不洗。7. 雜交：按每張切片20μl雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開(kāi)后，蓋在切片上。恒溫箱40-42℃雜交過(guò)夜。,9. 滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗。10. 滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃60分鐘或20℃左右120分鐘。05M PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。11. 滴加SABC：37℃20分鐘或20℃左右30分鐘。0.5M PBS洗5分鐘×

58、3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。12. 滴加生物素化過(guò)氧化物酶：37℃20或20℃左右30分鐘。0.5M PBS洗5分鐘×4次。13. DAB顯色: 使用DAB顯色試劑盒1ml蒸餾水加顯色劑A、B、C各一滴，混勻，加至標(biāo)本上。一般顯色20-30分鐘。若無(wú)背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。14. 必要時(shí)蘇木素更染，充分水洗。15. 酒精脫水，二甲苯透明，封片。,二、石蠟切片

59、如果有條件的話，應(yīng)盡可能地采用新鮮標(biāo)本。標(biāo)本離體后，及時(shí)予以固定。固定液為4％多聚甲醛/0.1M PBS（pH7.0-7.4），含有1/1000 DEPC。標(biāo)本較大時(shí)用刀片切成厚度不超過(guò)4mm的小塊，固定2小時(shí)即可，較大的標(biāo)本固定不要超過(guò)4小時(shí)。某些組織對(duì)過(guò)度固定大其敏感，如動(dòng)物大腦，固定時(shí)間一定不要超過(guò)1小時(shí)。1. 常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。2. 玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。3. 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟

60、至水。3%H2O2室溫處理10分鐘。蒸餾水洗滌2次。,4. 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3％檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶（1ml 3％檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻），37℃消化10-60分鐘。用戶可以比較不同的消化時(shí)間，例如10分鐘，20分鐘，30分鐘和60分鐘，以找到最佳的消化時(shí)間。0.5M PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-15步相同。結(jié)果觀察：BCL-2 mRNA的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色。

61、注意事項(xiàng)：如果有少量的細(xì)胞核著色屬于正常情況；如果出現(xiàn)大量的細(xì)胞核著色，往往和標(biāo)本固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有關(guān)，應(yīng)重新處理標(biāo)本。有其它明顯的非特異性染色現(xiàn)象時(shí)，可以用預(yù)雜交液對(duì)含探針的雜交液進(jìn)行稀釋，一般稀釋2-5倍。,P53 ISH 人結(jié)腸癌P53原位雜交染色，DAB顯色。,NM23 ISH 人前列腺nm23基因原位雜交染色，DAB顯色，癌細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性染色。,NMDA-2A ISH 大鼠標(biāo)本谷氨酸受體NMDAR2A基因原位雜交染色，DBA顯色，神

62、經(jīng)元呈強(qiáng)陽(yáng)性染色。,TIMP-2 ISH 大鼠病肝臟TIMP-2基因原位雜交染色，DAB顯色，病變肝細(xì)胞呈強(qiáng)弱不等的染色。,MCAS-Se,WiDr-Se,MCAS-H,WiDr-H,,,Protocol for In situ hybridization of cultured cells1. Put APES coating coverslips in dish for cell culture till cell confl

63、uent?2. Wash coverslips with PBS(-) for 5 min 1 times at R.T.?3. Fix by 4% Paraformadehyde/PBS for 15 min at R.T.?4. Wash by PBS(-) for 5 min? 3 at R.T.)?5. Wash by autoclaved MilliQ water 5 min?1 at R.T.?6

64、. Air dry by blower (dryer) in Clean Bench for 30 min?7. Dry in incubator for 3 hours or overnight at 45?C ?8. Store coverslips in RNase free slide case (treated with DEPC water and 70% EtOH), Sealed and store in

65、–80?C. (Store at -20?C for 1-2 months) or aluminum foil,?9. Return slide case to R.T.?10. Rinse in PBS for 5 min ×3?11. Rinse in 0.2N HCl for 20 min at R.T.,?12. Rinse in 0.2% Triton X-100/PBS and shake for

66、 10 min ?13. Digested by Proteinase K in TE buffer (1?g/ml) for 15-20 min at 37?C ? (300?l /slide)14. Fix with 4% paraformadehyde/0.1M PB for 5-10 min at R.T.?15. Rinse in 0.2% (2mg/ml) Glycine/0.1M PB for

67、15 min ×2 at R.T. ? (300?l /slide)16. Rinse in 40%formamide/ 4×SSC for 30 min at R.T.?17. Add hybridization solution containing H or Se RNA probe (10?l /200 -300?l) on slide and cover with coverslip

68、s in moist chamber (with 50% formamide and 2?SSC) (200 ?l/slide) overnight at 45-55?. (200 ?l/slide),?18. Remove the slides in 2?SSC-0.1%SDS?19. Wash with 2?SSC-0.1%SDS for 15 min?2 and shake at 45-55?C?20. Wash wit

69、h 0.2?SSC-0.1%SDS for 15 min?2 and shake at 45-55?C?21. Wash with Buffer A (0.1M Tris-HCl/0.15M NaCl, pH 7.5), shake for 10 min?2?22. Add Blocking Solution (1% Blocking reagent in Buffer A) for 30 min (200 ?l/slide

70、)?23. Remove the Blocking solution?24. Add 200 ?l solution of Anti-DIG complex in Blocking Solution on coverslips, then in moist chamber with 2?SSC for 30 min (or at 4?overnight) (1:1000-1:2000 diluted, 1.5?l/1.5ml),