免疫學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用

1、免疫學(xué)基礎(chǔ)及常用免疫檢驗(yàn)技術(shù),,,,,,1,免疫學(xué)基礎(chǔ),,,,,3,項(xiàng)目介紹,,,,,,,,,,2,免疫技術(shù),免疫學(xué)基礎(chǔ),免疫學(xué)概念,免疫是機(jī)體識(shí)別自我物質(zhì)和排除異己物質(zhì)的生物學(xué)反應(yīng),是動(dòng)物長(zhǎng)期進(jìn)化中所形成的一種生理功能。免疫學(xué)：研究機(jī)體自我識(shí)別和對(duì)抗原性異物排斥反應(yīng)的一門科學(xué)。,抗原(antigen,Ag) 能誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的抗體或效應(yīng)細(xì)胞在體內(nèi)外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)均稱為抗原 抗

2、體(antibody,Ab) 在抗原物質(zhì)刺激下，由B細(xì)胞分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。,免疫系統(tǒng) 人體內(nèi)存在一個(gè)負(fù)責(zé)免疫功能的完整的解剖體系即免疫系統(tǒng)，與神經(jīng)和內(nèi)分泌等其他系統(tǒng)一樣，這個(gè)系統(tǒng)有著自身的運(yùn)行機(jī)制并可以與其他系統(tǒng)相互配合，相互制約，共同維持機(jī)體在生命過(guò)程中總的生理平衡。,免疫系統(tǒng)的組成,免疫組織與器官 中樞器官（骨髓、胸腺）

3、 外周免疫器官（淋巴結(jié)、脾臟、黏膜淋巴組織）免疫細(xì)胞 淋巴細(xì)胞（T、B、NK（自然殺傷細(xì)胞）） 輔助細(xì)胞（吞噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC））免疫分子 免疫球蛋白、補(bǔ)體系統(tǒng)、細(xì)胞因子、黏附分子、CD抗原,免疫應(yīng)答 指機(jī)體免疫系統(tǒng)接受抗原刺激發(fā)生一系列反應(yīng)，并以排出或分解該抗原為目的的反應(yīng)過(guò)程。免疫應(yīng)答的過(guò)程 1、識(shí)別階段 2、活化階段

4、 3、效應(yīng)階段,免疫系統(tǒng)的功能,免疫防御（immunological defence）: 機(jī)體排斥外源性抗原異物的能力免疫自穩(wěn)（immunological homeostasis）: 機(jī)體識(shí)別和清除自身衰老殘損組織、細(xì)胞的能力，是機(jī)體籍以維持正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制免疫監(jiān)視（immunological surveillance）: 機(jī)體殺傷和清除異常突變細(xì)胞的能力，機(jī)

5、體籍以監(jiān)視和抑制惡性腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng),機(jī)體免疫功能,免疫防御,自我穩(wěn)定,免疫監(jiān)視,正常免疫：防御病原微生物的侵害和中和其毒素異常免疫：反應(yīng)過(guò)高引起變態(tài)反應(yīng)，過(guò)低引起免疫缺陷病正常免疫：清除體內(nèi)自然衰老或損傷的細(xì)胞異常免疫：識(shí)別紊亂造成自身免疫疾病正常免疫：清除復(fù)制錯(cuò)誤或突變細(xì)胞異常免疫：功能失調(diào)時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞癌變或持續(xù)性感染,,免疫檢驗(yàn),免疫檢驗(yàn)是研究免疫學(xué)技術(shù)在臨床領(lǐng)域應(yīng)用的一門科學(xué)。免疫檢驗(yàn)分為兩部分：利用免疫檢

6、測(cè)原理和技術(shù)檢測(cè)免疫活性細(xì)胞、抗體、抗原、補(bǔ)體、細(xì)胞因子、細(xì)胞粘附分子等免疫相關(guān)物質(zhì)利用免疫檢測(cè)原理與技術(shù)檢測(cè)體液中的微量物質(zhì)如激素、酶、血漿微量蛋白等,免疫檢測(cè)結(jié)果為臨床確定診斷、分析病情、調(diào)整治療方案和判斷預(yù)后等提供了有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。,臨床免疫學(xué),免疫性疾病 自身免疫性疾病、免疫缺陷病、免疫增殖病移植免疫 移植后保證移植物存活，不發(fā)生排斥 移植類型 HLA抗原腫瘤免疫

7、 腫瘤標(biāo)志物（診斷 治療 流式細(xì)胞術(shù)）感染免疫 感染性疾病的診斷,顆粒性抗原的獲得 1.細(xì)胞抗原（紅細(xì)胞） 2.細(xì)菌抗原（菌體抗原、鞭毛抗原） 3.寄生蟲(chóng)體抗原,如何獲取抗原（一）,可溶性抗原的獲取 1.體液、分泌液（血清、血漿、尿液、精液、乳汁、唾液等） 2.組織細(xì)胞培養(yǎng)物等 利用機(jī)械破碎法（搗碎、研磨法）、反復(fù)凍

8、融、超聲法、酶法、表面活性劑 3.分子生物學(xué)技術(shù)制備抗原 分子克隆表達(dá)蛋白質(zhì),如何獲取抗原（二）,抗體的制備（一）,多克隆抗體的制備 1.免疫動(dòng)物的選擇 常用家兔、綿羊、鼠、雞、山羊、馬 2.抗原接種 劑量、接種途徑、間隔時(shí)間 3.采血提取抗體與純化 4.抗體純度鑒定,抗體的制備（二）,單克隆抗體的制備 利用雜交瘤技術(shù)篩選出雜交瘤

9、細(xì)胞，具備永生化和能產(chǎn)生表位單一的抗體，將雜交瘤細(xì)胞接種小鼠腹腔或進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，可獲得大量單克隆抗體。 基因工程抗體的制備 利用分子生物學(xué)技術(shù)人為進(jìn)行抗體的構(gòu)建,免疫檢驗(yàn)技術(shù),免疫檢測(cè)技術(shù)的類型,酶免疫技術(shù),酶免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶高效催化反應(yīng)的專一性相結(jié)合的一種免疫檢測(cè)技術(shù)。它是將酶與抗體或抗原結(jié)合成酶標(biāo)記抗體或抗原，此結(jié)合物既保留了抗體或抗原的免疫學(xué)活性，同時(shí)又保留了酶對(duì)底物的催化活性,主要試劑

10、: 酶標(biāo)記的抗體或抗原酶標(biāo)物特點(diǎn)： 免疫學(xué)活性 酶對(duì)底物的催化活性,,抗原抗體反應(yīng)的特異性,+,酶高效催化反應(yīng)的專一性,原理及特點(diǎn),特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好酶標(biāo)記試劑能夠較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定操作簡(jiǎn)便、對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法。,原理：酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)對(duì)抗原或抗體進(jìn)行

11、定位、定性或定量的測(cè)定分析,原理及特點(diǎn),酶免疫技術(shù)-分類,酶免疫測(cè)定(Enzyme immunoassay,EIA):用于液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量酶免疫組織化學(xué)技術(shù)：主要用于組織切片或其他標(biāo)本中抗原的定位,酶免疫技術(shù)-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA,ELISA,1971年瑞典學(xué)者En

12、gvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者Van Weerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。,抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學(xué)活性；抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和

13、酶學(xué)活性；酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。,基本原理,它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。,在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作

14、用的底物（顯色劑）,測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，,再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。,其所生成的顏色深淺與欲測(cè)的抗原（抗體）含量成正比。 這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）加以測(cè)定。

15、 其方法簡(jiǎn)單，方便訊速，特異性強(qiáng)。,ELISA的分類,,（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競(jìng)爭(zhēng)法 （四）雙位點(diǎn)一步法（五）捕獲法測(cè)IgM抗體（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA,（一）雙抗體夾心法,此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,獲得待分析物的未標(biāo)定抗體,,將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體,,洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì),,加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn),洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白,加受檢

16、標(biāo)本（抗原）形成固相抗體－抗原復(fù)合物,洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì),加酶標(biāo)抗體生成抗體—待測(cè)抗原—酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物,徹底洗滌未結(jié)合的 酶標(biāo)抗體,加底物進(jìn)行酶催化反應(yīng),根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測(cè)定,,,,,,,,間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。,（二）間接法,包被固相載體: 用已知抗原包被固相載體,,加待檢標(biāo)本: 使相應(yīng)抗體與固相抗原

17、結(jié)合洗滌，除去無(wú)關(guān)的物質(zhì),,加酶標(biāo)抗抗體:與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體,,加底物顯色,根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測(cè)定,,（三）競(jìng)爭(zhēng)法,此法可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體 。,用已知特異性抗體包被固相載體,,,測(cè)定管加待測(cè)抗原和一定量的酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,對(duì)照管只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體直接結(jié)合,,分別洗滌除去未結(jié)合的成分,,加底物顯色

18、,分別測(cè)定兩管的吸光度值，根據(jù)對(duì)照管與測(cè)定管吸光度值之比， 計(jì)算標(biāo)本中待測(cè)抗原含量,,酶免疫反應(yīng)中的常用酶,1.辣根過(guò)氧化物酶（HRP）（最常用） horseradish peroxidase, HRP來(lái)源于辣根,易于提取，價(jià)廉，性穩(wěn)定。2.堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）3.β-半乳糖苷酶,酶免疫反應(yīng)中常用底物,1.HRP的底物辣根過(guò)氧化物酶催化的反應(yīng)式：DH2+H2O→2D+2H2O現(xiàn)

19、在最常用的HRP底物： 四甲基聯(lián)苯胺（TMB），TMB經(jīng)HRP作用后變?yōu)樗{(lán)色，加入硫酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色，檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm,ELISA廣泛用于傳染病的診斷，病毒如病毒性肝炎(甲肝抗體、“乙肝三對(duì)”、丙肝抗體、丁肝抗體、戊肝抗體)、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細(xì)菌如結(jié)核桿菌、幽門螺桿菌等。 也用于一些蛋白質(zhì)檢測(cè)，如各種免疫球蛋白、補(bǔ)體、腫瘤標(biāo)志物(甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特異性抗原等)。,酶免疫技術(shù)的應(yīng)用,酶

20、免疫技術(shù)的應(yīng)用,,生物素-親合素放大技術(shù)在酶免測(cè)定的應(yīng)用,生物素-親和素系統(tǒng)（BAS） 生物素（biotin）、親合素（avidin）是一對(duì)具有高度親合力的物質(zhì)，其結(jié)合穩(wěn)定，具有多級(jí)放大效應(yīng)將BAS與ELISA偶聯(lián)起來(lái)，可大大提高ELISA測(cè)定的靈敏度，每個(gè)親合素可結(jié)合4個(gè)生物素，可使反應(yīng)明顯放大。,熒光免疫技術(shù),熒光免疫技術(shù)(immunofluorescence technique， IFT)將抗原抗體反應(yīng)與熒光檢測(cè)

21、技術(shù)相結(jié)合而建立的一種標(biāo)記免疫技術(shù)，具有高度的特異性、敏感性和直觀性。,1. 熒光免疫測(cè)定技術(shù)的概念： 將試劑抗原或試劑抗體用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，試劑與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，測(cè)定復(fù)合物中的熒光素，這種免疫技術(shù)，稱為免疫熒光素技術(shù)。,2. 分類： ⑴熒光抗體技術(shù)(熒光顯微鏡技術(shù)) 抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判 定結(jié)果的檢測(cè)方法。 ⑵ 免疫熒光測(cè)定技術(shù)：

22、 抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測(cè)定 熒光強(qiáng)度而推算被測(cè)物濃度的檢測(cè)方法,3 .熒光的產(chǎn)生： 物質(zhì)吸收外界能量而進(jìn)入激發(fā)狀態(tài)，在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以電磁輻射的形式釋放，即發(fā)光，這種光稱為熒光。這種物質(zhì)，稱為熒光素 . 由光激發(fā)所引起的熒光，為光致熒光 -

23、-----熒光免疫技術(shù) 由化學(xué)反應(yīng)所引起的熒光，為化學(xué)熒光 ------化學(xué)發(fā)光技術(shù),4 熒光素的熒光特性： ⑴ 停止供能，熒光現(xiàn)象隨即終止 ⑵ 對(duì)光的吸收和熒光的發(fā)射具高度選擇性 入射光波長(zhǎng)<發(fā)射光波長(zhǎng) ⑶ 熒光效率： 發(fā)射熒光的光量子數(shù)

24、 熒光效率= 吸收光的光量子數(shù) ⑷ 熒光猝滅現(xiàn)象：熒光素的輻射能力減弱,,免疫檢測(cè)常用的熒光素,1.異硫氰酸熒光素（FITC） 黃色或橙黃結(jié)晶，吸收收波長(zhǎng)490-495nm，發(fā)射波長(zhǎng)520-530nm，呈黃綠色熒光。2.四乙基羅丹明（RB200） 桔紅色粉末，吸收λmax=570，發(fā)射波長(zhǎng)595-600nm,呈桔紅色

25、熒光。3.四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）4.藻紅蛋白（PE） PE常與FITC合用于雙色免疫熒光染色,三、熒光抗體技術(shù)： ㈠抗原片的制作 ㈡試驗(yàn)類型 ㈢熒光顯微鏡檢查,㈠抗原片的制作,1 制作：臨床常見(jiàn)的標(biāo)本有組織、細(xì)胞細(xì)菌三大類?？刹捎猛科?、印片或切片方式制備抗原片。細(xì)胞采用涂片、印片或切片的方式制備抗原片。,2 標(biāo)本的固定： ⑴ 固定目的防止細(xì)胞

26、、細(xì)菌或切片從玻片上脫落。去除組織中妨礙抗原抗體結(jié)合的類脂質(zhì)。易于保存。（但CD、SIg的檢測(cè)不進(jìn)行固定，而采用活細(xì)胞染色）。,⑵ 常用的固定方法：抗原 固定劑 固定方法蛋白質(zhì) 95%乙醇 室溫3~10min或4℃30min Ig類 甲醇

27、 同上酶類 丙酮 同上激素 CCl4 同上類脂質(zhì) 10%福爾馬林 室溫3~10min多糖(細(xì)菌) 10%福爾馬林

28、 室溫3~10min或4℃30min 丙酮、甲醇病毒 無(wú)水乙醇 室溫5~10min或4℃30~60min 丙酮、CCl4 或-20 ℃60min以上,,,,,,,,,㈡試驗(yàn)類型 1 直接法 2 間接法