呼吸道感染的微生物檢驗(yàn)

1、如何提高呼吸道感染的病原學(xué)診斷,,呼吸道感染（RTI）,呼吸道感染（RTI）是一種常見病、多發(fā)病、高居門、急診就診患者人數(shù)的首位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年有近5億人感染呼吸系統(tǒng)疾病，7歲以下兒童平均每人每年患急性RTI 3~4次。RTI是抗菌藥物使用頻率最高、用量最多的疾病?？咕幬锍霈F(xiàn)使感染性疾病病死率下降。人類平均壽命延長(zhǎng)。然而，由于濫用抗生素，導(dǎo)致菌群失調(diào)，耐藥菌株逐年增多，如：MRSA、ESBL、 SSBL、 VRSA、VRE等超級(jí)

2、細(xì)菌。耐藥菌感染成為除癌癥、心腦血管疾病和AIDS外威脅人類健康的第四大醫(yī)學(xué)問(wèn)題?？咕幬锏牟缓侠硎褂檬且粋€(gè)世界范圍的現(xiàn)象，抗菌藥物總產(chǎn)量的一半用于動(dòng)物，在人類使用的另一半中，近50%用于呼吸道感染。,什么是呼吸道感染,呼吸道感染包括鼻、咽、喉、氣管、支氣管及肺部的感染性炎癥。呼吸道以環(huán)狀軟骨為界，分為上、下呼吸道。上呼吸道包括鼻、咽、喉，其感染稱上呼吸道感染。下呼吸道包括氣管、主支氣管、葉、段支氣管直至肺泡，其感染稱下呼吸道感染。上

3、呼吸道感染主要病原體：細(xì)菌和病毒下呼吸道感染病原體包括：細(xì)菌、病毒、真菌、支原體、衣原體、立克次體等微生物及較少見的原蟲、吸蟲、絳蟲等寄生蟲。,合理的診斷,常見下呼吸道感染有：社區(qū)獲得性肺炎（CAP）、醫(yī)院獲得性肺炎（HAP）呼吸機(jī)相關(guān)肺炎（VAP）、慢性阻塞性肺疾病急性加重（AECOPD）等。對(duì)于這些疾病，合理用藥延緩耐藥發(fā)展的前提條件是對(duì)病原菌的正確診斷。對(duì)于重癥肺部感染，只有找到病原菌，才能選擇正確的抗菌藥物，合理用藥，避免耐藥

4、的發(fā)生。目前臨床對(duì)病原學(xué)診斷的重要性認(rèn)識(shí)不足，常常滿足于經(jīng)驗(yàn)性治療，經(jīng)常見到病因模糊的診斷如“慢性肺炎”；“不明原因肺炎或肺部感染”的診斷屢見不鮮。臨床與微生物檢驗(yàn)脫節(jié)；臨床醫(yī)生不相信細(xì)菌室的報(bào)告，對(duì)合格標(biāo)本的取材認(rèn)識(shí)不足；微生物室不關(guān)心患者情況，回報(bào)時(shí)間晚，陽(yáng)性率低；檢驗(yàn)設(shè)備、科研投入不足。這些均限制了病原學(xué)診斷的發(fā)展。,,,,,初診患者的主要癥狀是咳嗽、咳痰、高熱、胸痛，可伴有呼吸異常、咯血,診斷肺炎的典型癥狀體檢發(fā)現(xiàn)：*熱

5、病容，少數(shù)病人有呼吸急迫和紫紺。*患側(cè)呼吸度減弱，語(yǔ)顫可增強(qiáng)或減弱，叩診有濁音，聽診可有支氣管呼吸音或濕羅音，少數(shù)病人可有胸膜摩擦音或呼吸音減弱。胸部X線檢查：炎性浸潤(rùn)陰影也可出現(xiàn)肺葉實(shí)變、空洞形成、胸腔積液。病原學(xué)檢查：*痰或胸水涂片檢查，培養(yǎng)致病菌及抗生素敏感試驗(yàn)，連做2、3次。*免疫熒光，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，對(duì)流免疫電泳等方法檢測(cè)血清病原菌的抗原或抗體。*聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)病原體。血液檢查：細(xì)菌感染者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)及中性粒

6、細(xì)胞一般均升高，可有核左移。其他輔助檢查：必要時(shí)進(jìn)行血?dú)夥治?，肝、腎功能、血清電解質(zhì)等相關(guān)檢查。,誘發(fā)因素上呼吸道病毒感染突然受寒、饑餓、疲勞、醉酒等，消弱全身抵抗力。某些慢性疾病患者，如免疫缺陷。糖尿病，腎功能衰竭。,危險(xiǎn)因素1.COPD/支擴(kuò)/陳舊肺結(jié)核/肺間質(zhì)纖維化等基礎(chǔ)肺疾病2.糖尿病3.慢性心、腎功能不全4.慢性肝疾患5.誤吸或易致誤吸因素6.脾切除術(shù)后7.慢性酗酒或營(yíng)養(yǎng)不良，吸煙8.精神狀態(tài)改變9.

7、近一年內(nèi)因社區(qū)獲得性肺炎住院史,,,,,,,,,呼吸道感染診斷,治療原則,合理使用抗生素 在用藥前，盡早采集標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)，明確病原學(xué)診斷，以便針對(duì)性使用敏感的抗菌藥物。在細(xì)菌病原學(xué)未分離出來(lái)前，先采取經(jīng)驗(yàn)性治療。,,,,,,,,,,,,,,病人的分組和經(jīng)驗(yàn)治療,1,Ⅰ組門診病人，60歲以下，無(wú)危險(xiǎn)因素，輕-中癥肺炎,常見病原菌肺炎鏈球菌，肺炎衣原體，肺炎支原體，流感嗜血桿菌,適用抗生素大環(huán)內(nèi)酯類、青霉素、多西環(huán)

8、素、第一代頭孢、喹諾酮類復(fù)方新諾明,Ⅱ組門診病人，60歲以上或有危險(xiǎn)因素，輕-中癥肺炎,常見病原菌肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、需氧革蘭氏陰性桿菌、金黃色葡萄球菌、卡他莫拉菌,適用抗生素第二代頭孢、β-內(nèi)酰胺類 / 酶抑制劑氟喹諾酮類尚可加用大環(huán)內(nèi)酯類,Ⅲ組住普通病區(qū)的住院病人,常見病原菌肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、需氧革蘭氏陰性桿菌、金黃色葡萄球菌、混合菌（包括厭氧菌）、肺炎衣原體、銅綠假單胞菌,適用抗

9、生素第二代頭孢、頭孢噻肟/ 頭孢曲松/ 頭孢吡肟β-內(nèi)酰胺類 / 酶抑制劑氟喹諾酮類上述藥物可加用大環(huán)內(nèi)酯類,Ⅳ組住ICU的病人,常見病原菌肺炎鏈球菌、需氧革蘭氏陰性桿菌、軍團(tuán)菌、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌,適用抗生素頭孢噻肟/ 頭孢曲松/ 抗假單胞菌β-內(nèi)酰胺類 / 酶抑制劑碳青霉烯類氟喹諾酮類+氨基糖苷類尚可加用大環(huán)內(nèi)酯類,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

10、,,,,,,,,,,,,病原特異性治療 參考09年CLSI抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),1,肺炎鏈球菌,首選青霉素和阿莫西林,次選β-內(nèi)酰胺類 / 酶抑制劑喹諾酮類,其他大環(huán)內(nèi)酯類四環(huán)素類,厭氧菌,腸桿菌屬包括變形桿菌克雷伯菌屬大腸埃希菌,金黃色葡萄球菌,軍團(tuán)菌屬,首選青霉素/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑甲硝唑、克林霉素,,首選第三代頭孢菌素可加用氨基糖苷類,,耐甲氧西林菌株：首選-萬(wàn)古霉素對(duì)甲氧西林敏感菌株：首選-

11、耐酶合成青霉素，如氯唑西林萘夫西林苯唑西林雙氯青霉素鈉第一代頭孢菌素,,首選紅霉素+利福平喹諾酮類,次選其他β-內(nèi)酰胺 / β-內(nèi)酰胺酶抑制劑,次選碳青霉烯類,耐甲氧西林菌株：次選-利福平、磷霉素、夫西地酸對(duì)甲氧西林敏感菌株：次選-萬(wàn)古霉素、克林霉素,次選其他大環(huán)內(nèi)酯類,其他氨基糖苷類林可霉素,其他氨曲南青霉素類/ 酶抑制劑喹諾酮類,其他氨基糖苷類大環(huán)內(nèi)酯類復(fù)方新諾明,其他多西環(huán)素復(fù)方新

12、諾明,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,病原特異性治療（續(xù)）,1,銅綠假單胞菌,流感嗜血桿菌,支原體或衣原體,卡他莫拉菌,首選氨基糖苷類或環(huán)丙沙星，加以下任一具有抗假單胞菌活性的抗生素：半合成青霉素類（如替卡西林、哌拉西林、美洛西林）；頭孢菌素類（如頭孢他啶、頭孢吡肟）、氨曲南,首選第二、三代頭孢菌素青霉素類,首選多西環(huán)素大環(huán)內(nèi)酯類,首選第二、三代頭孢菌素復(fù)方新諾明,次選碳青霉

13、烯類（如亞胺培南或美洛培南）氟喹諾酮類,次選β-內(nèi)酰胺類 / 酶抑制劑氟喹諾酮類,次選氟喹諾酮類,次選大環(huán)內(nèi)酯類青霉素類/ 酶抑制劑,其他大環(huán)內(nèi)酯類四環(huán)素類復(fù)方新諾明,其他四環(huán)素類,其他喹諾酮類,,,,,,,,,,,,,,,請(qǐng)以藥敏試驗(yàn)結(jié)果來(lái)指導(dǎo)用藥，并合理運(yùn)用最新CLSI標(biāo)準(zhǔn)來(lái)合理解釋結(jié)果的可靠性,細(xì)菌室做藥敏試驗(yàn)的幾點(diǎn)原則,1、只有懷疑該分離菌為感染病原菌時(shí)才做藥敏試驗(yàn)。2、一定要用CLSI規(guī)定的藥敏試驗(yàn)

14、方法或廠家提供的說(shuō)明書來(lái)操作和解釋結(jié)果。3、只選擇合適于靶細(xì)菌及感染靶位的抗菌藥物進(jìn)行測(cè)試和向臨床報(bào)告。4、要頻繁地進(jìn)行質(zhì)控工作以確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。5、要加快向臨床或感控部門報(bào)告無(wú)菌部位、全身感染發(fā)現(xiàn)的致病菌、耐藥類型和藥敏信息以及致病性強(qiáng)或有意義的不常見菌株，如鼠疫桿菌、炭疽桿菌、布氏桿菌等毒株；諾卡菌、分枝桿菌、放線菌、侵襲性真菌等。同時(shí)還要報(bào)告院內(nèi)多重耐藥株的爆發(fā)流行。這樣做是可以較好地解決臨床科室與細(xì)菌室之間上面提到一些

15、溝通方面的問(wèn)題的。,如何提高診斷水平,首先要明白什么是痰？在人體氣管、支氣管的內(nèi)壁都覆蓋著一層黏膜，由纖毛柱狀上皮和杯狀細(xì)胞組成，在黏膜下層含較多的黏液腺和漿液腺，腺體導(dǎo)管開口于黏膜表面。正常情況下，杯狀細(xì)胞和腺體分泌少量黏液覆蓋在黏膜層表面，對(duì)黏膜層起保護(hù)作用。可保持氣管黏膜的濕潤(rùn)，以便把吸入氣管、支氣管內(nèi)的塵埃顆粒、細(xì)菌等黏附，阻擋其進(jìn)入肺組織深處，然后再借助纖毛柱狀上皮的纖毛擺動(dòng)，把他們排到氣管上端的喉頭部位，經(jīng)口腔咳出，咳出物

16、就是痰。 病理狀態(tài)下的痰：當(dāng)氣管、支氣管、肺受到有害因素或致病菌感染發(fā)生炎癥時(shí)，黏液大量分泌，有利于清除異物。但黏液分泌過(guò)多，加重了纖毛柱狀上皮細(xì)胞的負(fù)擔(dān)，不利于黏液的排出，在細(xì)菌及其毒素的作用下，產(chǎn)生一些變性壞死組織細(xì)胞，潴留在支氣管內(nèi)，黏液和這些變性壞死的組織細(xì)胞就構(gòu)成了病理狀態(tài)下的痰。痰液檢查的目的：（1）協(xié)助診斷某些呼吸系統(tǒng)疾病，如支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張等；（2）確診某些呼吸系統(tǒng)疾病，如肺結(jié)核、肺癌、肺吸蟲病等；（3）觀察療

17、效和預(yù)后判斷。,如何提高診斷水平,一、臨床醫(yī)生應(yīng)當(dāng)注意標(biāo)本的正確取材。采集合格標(biāo)本對(duì)細(xì)菌的診斷尤為重要送檢指征：凡是發(fā)熱、咳嗽和咳痰，痰呈膿性、粘稠或血性，并伴有胸痛、氣急、肺部聞及濕羅音，外周血白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞比例明顯增高，X線檢查提示肺部有炎癥性浸潤(rùn)或胸腔積液，甚至出現(xiàn)感染性休克和呼吸衰竭等患者，應(yīng)該采集痰液或下呼吸道標(biāo)本送細(xì)菌室檢驗(yàn)。正確的采集時(shí)間和頻率：（1）在抗菌素應(yīng)用前采集（2）最好在清晨采集痰標(biāo)本；多數(shù)患者

18、在清晨痰較多，且含菌量也多，即使對(duì)痰量少的患者，也以清晨最為容易。（3）對(duì)于細(xì)菌性肺炎，痰標(biāo)本送檢每天1次，連續(xù)2~3天；不建議24h內(nèi)多次采集，除非痰液外觀性狀出現(xiàn)改變（4）懷疑分枝桿菌感染者，應(yīng)連續(xù)收集3天清晨痰液送檢。,正確的采集方法,正確的采集方法：（1）自然咳痰法：留取前刷牙，用清水漱口3次(或硼酸漱口），以除去口腔內(nèi)大部分雜菌，之后用力咳出呼吸道深部的痰液吐到無(wú)菌廣口瓶?jī)?nèi)。蓋好蓋子?；颊咛狄狠^深不易咳出時(shí)，可在咳痰前捶

19、背、協(xié)助排痰。采集的痰量不少于1ml。（2）經(jīng)支氣管鏡抽吸法：纖維支氣管鏡檢查可直接從肺部感染病灶獲取支氣管分泌物，到那不能完全避免咽喉部正常菌群污染。適用于不能咳出足夠量痰液的患者。常用：支氣管肺泡灌洗液（BALF）、防污染樣本毛刷（PSB）其中BALF可收集較大范圍肺實(shí)質(zhì)的肺泡表面襯液標(biāo)本，對(duì)肺部感染如結(jié)核、霉菌等感染可提高細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)率和培養(yǎng)陽(yáng)性率。對(duì)于普通細(xì)菌感染者其細(xì)菌培養(yǎng)≥105cfu/ml 時(shí)為確定感染的閾值。但對(duì)于某些

20、特殊感染，如在肺泡灌洗液中分離出結(jié)核分枝桿菌、軍團(tuán)菌即可做出診斷。對(duì)卡氏肺孢子菌的感染敏感性為85%~90%。（3）經(jīng)人工氣道吸引分泌物（ETA）：目前較為常用的微生物檢驗(yàn)標(biāo)本（4）經(jīng)氣管穿刺吸引物（TTA）：采集到的下呼吸道標(biāo)本不受上呼吸道正常菌群污染。效果好，但患者通常不會(huì)接受，適用于高度懷疑厭氧菌感染者和昏迷患者。,,（5）經(jīng)胸壁針刺吸引物（TNA）：對(duì)于感染性疾病，僅用來(lái)診斷一些不明原因的肺炎（尤其兒童）（6）胃內(nèi)采痰法：

21、清晨空腹時(shí)，將胃管插入胃內(nèi)，用注射器抽取胃液。適用于無(wú)自覺癥狀的肺結(jié)核病人或者嬰幼兒不會(huì)咳嗽，常將痰液吞咽入胃，可通過(guò)采集胃內(nèi)容物做結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，不適合其他細(xì)菌培養(yǎng)。（7）小兒取痰法：用彎壓舌板向后壓舌，用棉拭子伸入咽部，小兒因壓舌刺激咳嗽時(shí)，可噴出肺部或氣管分泌物粘附在拭子上，從而獲得標(biāo)本。（8)物化蒸汽吸入法：適用于無(wú)痰和極少痰的患者。用3%~5%Nacl,霧化吸入進(jìn)行導(dǎo)痰。 對(duì)肺組織標(biāo)本，臨床常常重視病理檢查，

22、而忽略了微生物檢驗(yàn)。對(duì)于疑難病例，送病理的同時(shí)，應(yīng)同時(shí)送細(xì)菌室進(jìn)行細(xì)菌學(xué)的涂片、鏡檢和培養(yǎng)。送檢時(shí)將肺組織標(biāo)本浸泡在0.2~0.5ML的無(wú)菌生理鹽水中，以防其干燥。,呼吸道標(biāo)本運(yùn)送,不可接受的標(biāo)本包括唾液樣痰、24h收集的痰和拭子。臨床醫(yī)生應(yīng)當(dāng)督導(dǎo)患者咳出合格的痰標(biāo)本，而非唾液。下呼吸道標(biāo)本應(yīng)在采集后立即（20min內(nèi)）送至細(xì)菌室，并于1h內(nèi)接種，室溫下放置超過(guò)2h會(huì)降低肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌的分離率，這是由于定植于上呼吸道的非致病

23、菌過(guò)度生長(zhǎng)所致。特別需要注意的是，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等苛養(yǎng)菌不喜低溫，此類下呼吸道標(biāo)本勿冷藏。 不能及時(shí)接種的標(biāo)本可以4℃冰箱保存（疑為肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等苛養(yǎng)菌感染不在此列），以免雜菌生長(zhǎng)。但保存標(biāo)本應(yīng)在24h內(nèi)處理。對(duì)可疑烈性呼吸道傳染?。ㄈ鏢ARS、肺炭疽、肺鼠疫等）的患者檢驗(yàn)標(biāo)本，在采集、運(yùn)送或保存過(guò)程中必須注意生物安全防護(hù)。,血培養(yǎng),血液：當(dāng)患者發(fā)熱體溫（≥38℃）或低體溫（≤36.0℃）時(shí)；或外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)

24、超過(guò)10×109個(gè)/L（特別是存在核左移時(shí)）；或粒細(xì)胞絕對(duì)值減少（成熟中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)少于1×109個(gè)/L）；或合并有明顯感染癥狀體征、伴有感染病灶存在時(shí)，應(yīng)當(dāng)及時(shí)抽血作2~3份血培養(yǎng)。“份數(shù)”是指“穿刺點(diǎn)”的數(shù)量，而非瓶子數(shù)。對(duì)于成人，每瓶血量應(yīng)為8~10ML。兒童患者，每瓶血量應(yīng)為1~5ML。,,當(dāng)懷疑厭氧菌感染或其他特殊細(xì)菌感染時(shí)，應(yīng)當(dāng)與細(xì)菌室聯(lián)系，并在必要時(shí)進(jìn)行床邊接種。臨床醫(yī)生應(yīng)及時(shí)與細(xì)菌室溝通，介紹患者病情

25、，征求細(xì)菌室的意見。對(duì)于肺組織的標(biāo)本，應(yīng)當(dāng)展開大撒網(wǎng)式檢測(cè)。及時(shí)溝通，有助于提醒細(xì)菌室在大撒網(wǎng)的同時(shí)，有所側(cè)重，以提高檢出的陽(yáng)性率。,二、微生物室應(yīng)當(dāng)重視下呼吸道標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)化操作。,所有痰標(biāo)本應(yīng)記錄其外觀和性狀，如膿痰、黏液膿痰、黏痰、水樣泡沫、血性等。每份標(biāo)本必須進(jìn)行涂片、革蘭氏染色鏡檢，評(píng)價(jià)痰標(biāo)本質(zhì)量。評(píng)價(jià)痰標(biāo)本質(zhì)量：目測(cè)：黃色、灰色、血性、鐵銹色，渾濁、 稠厚，呈現(xiàn)團(tuán)塊狀的標(biāo)本為合格標(biāo)本；而無(wú)色、白色、有黑色小點(diǎn)，清稀，呈現(xiàn)泡

26、沫狀，有明顯食物渣滓、紙屑灰塵、泥土的為不合格標(biāo)本。為什么鱗狀上皮細(xì)胞多的標(biāo)本不合格一般認(rèn)為，來(lái)自下呼吸道的合格標(biāo)本應(yīng)該是含膿細(xì)胞和支氣管柱狀上皮細(xì)胞較多，而受唾液污染嚴(yán)重的不合格標(biāo)本則來(lái)自頰粘膜的扁平鱗狀上皮細(xì)胞較多。,,1.下呼吸道細(xì)菌學(xué)標(biāo)本的涂片檢查：選擇標(biāo)本的膿性部分或帶血部分涂成均勻薄片，做革蘭氏染色鏡檢。低倍鏡下記錄細(xì)胞數(shù)，痰涂片顯微鏡檢查的分類如下：表1 分類 每低倍鏡下細(xì)胞

27、 （個(gè)） WBC 鱗狀上皮細(xì)胞 6類

28、 25 25 10~25 3類 >25 >25 2類 10~25

29、 >25 1類 25 注:分類中1~3類不做培養(yǎng)，要求重新留取標(biāo)本;4、5類為合格標(biāo)本；6類為氣管穿刺液時(shí)，如未見白細(xì)胞，而鱗狀上皮細(xì)胞>10個(gè)/LP時(shí)，亦應(yīng)重新留取標(biāo)本。不合格標(biāo)的痰標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)立即通知臨床重新留痰送檢。在涂片中如有柱狀上皮細(xì)胞不應(yīng)計(jì)數(shù)在鱗狀上皮細(xì)胞中，但應(yīng)注明其數(shù)量，作為合格

30、標(biāo)本對(duì)待。,,,,,,合格痰標(biāo)本應(yīng)當(dāng)記錄所見細(xì)菌等病原體情況。記錄細(xì)菌時(shí)要求按革蘭氏陽(yáng)性或陰性、球菌或桿菌等分別記錄平均每油鏡視野中細(xì)菌的大致數(shù)量。對(duì)于合格標(biāo)本，要記錄WBC內(nèi)有無(wú)吞噬的細(xì)菌，這樣的細(xì)胞占整個(gè)WBC總數(shù)的比例，細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的形態(tài)等。有文獻(xiàn)認(rèn)為，吞噬有細(xì)菌的WBC達(dá)到5%以上，對(duì)醫(yī)院獲得性肺炎（HAP）、呼吸機(jī)相關(guān)肺炎（VAP）的診斷有重要意義。,2.下呼吸道標(biāo)本的細(xì)菌培養(yǎng)：（1）標(biāo)本培養(yǎng)前處理：不含或含黏液很少的合格標(biāo)本

31、，可直接接種。遇到含有大量黏液的標(biāo)本，應(yīng)加入等量的sputosol(一種商品化的痰液溶解劑），作用20min溶解黏液，使痰液均質(zhì)化后接種。均質(zhì)化的目的：一般情況下病原菌感染肺部其部位在下呼吸道深部，炎性滲出物為了把炎癥局限就將病原菌包裹在其中，若直接接種于培養(yǎng)基上，包裹物中的細(xì)菌很難突破包裹在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而痰的均質(zhì)化有助于痰核內(nèi)部細(xì)菌暴露，以提高陽(yáng)性檢出率。（2）分離培養(yǎng)：將處理后的痰液接種于血瓊脂平板、含抗生素的巧克力瓊脂平板、

32、沙氏板、麥康凱瓊脂平板，接種后放置在5%~10%CO2孵育箱中，35℃培養(yǎng)18~24h，并根據(jù)菌落及形態(tài)特點(diǎn)做出初步判斷并進(jìn)行純培養(yǎng)或上細(xì)菌自動(dòng)鑒定儀。如24h無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)應(yīng)再放置24h，再觀察菌落生長(zhǎng)情況，如仍無(wú)生長(zhǎng)才報(bào)告48小時(shí)無(wú)致病菌生長(zhǎng)。（3）痰半定量：即用接種環(huán)將痰液在血平板和巧克力平板上按規(guī)定的劃線要求作三區(qū)劃線方式接種標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)。三區(qū)劃線方法：首先用無(wú)菌棉簽蘸取經(jīng)sputosol溶解的痰液（或?qū)⒔臃N環(huán)通過(guò)火焰滅菌，冷卻后

33、挑取少許標(biāo)本，盡量挑取有膿或血的部位），然后將其涂布在平板的第一區(qū)，并做數(shù)次劃線，再在二、三區(qū)依次用接種環(huán)劃線，每劃一區(qū)，應(yīng)將接種環(huán)燒灼一次，待冷卻后再劃下一區(qū)。

34、 第一區(qū)

35、第二區(qū) 第三區(qū),,,,,,,,,,,,血平板：適用于分離肺炎鏈球菌和其他細(xì)菌加萬(wàn)古霉素的巧克力平板：適用于分離流感嗜血桿菌麥康凱瓊脂平板：適用于分離革蘭氏陰性桿菌檢驗(yàn)程序 ：由于檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告的時(shí)效性，分為初步報(bào)告和最終結(jié)果報(bào)告。

36、 痰及呼吸道分泌物標(biāo)本,,,,,涂片、染色、鏡檢,,分離培養(yǎng),藥敏試驗(yàn),,,,,,,,,,,初步報(bào)告(一級(jí)報(bào)告）,選擇培養(yǎng)基適宜的培養(yǎng)條件,BP、CA、MAC、沙氏板,純培養(yǎng),分離鑒定（最終報(bào)告）,上細(xì)菌全自動(dòng)鑒定儀,一般細(xì)菌培養(yǎng),特殊細(xì)菌培養(yǎng),初步報(bào)告（二級(jí)報(bào)告）,菌落觀察,涂片、染色、鏡檢,,,,,,,最終報(bào)告（三級(jí)報(bào)

37、告）,,,表2. 上呼吸道存在的正常菌群正常菌群 正常菌群鏈球菌 棒狀桿菌 嗜血桿菌 厭氧球菌微球菌 類桿菌 凝固酶陰性葡萄球菌奈瑟菌

38、 梭桿菌表3 上呼吸道感染的常見病原體種類 革蘭染色陽(yáng)性 革蘭染色陰性球菌 金葡、凝固酶陰性葡、化鏈、肺鏈 腦膜炎奈瑟菌桿菌 結(jié)核分枝桿菌、白喉棒狀桿菌

39、、厭氧菌 肺克、大腸埃希菌、類桿菌、流感嗜血桿 麻風(fēng)分枝桿菌、炭疽芽孢桿菌 菌、不動(dòng)桿菌、腸桿菌、軍團(tuán)菌、百日咳 鮑特菌、銅綠假單胞菌、肺炎衣原體

40、真菌及其他 假絲酵母菌、放線菌、梭狀桿菌、奮森螺旋體表4 下呼吸道感染常見病原菌種類 革蘭染色陽(yáng)性 革蘭染色陰性球菌 金葡、凝固酶陰性葡、肺鏈、A群鏈、腸球菌 卡他球菌、腦膜炎奈瑟菌、黃色球菌桿菌 白喉棒狀桿菌、類白喉棒狀桿菌、

41、結(jié)核分枝桿 肺克、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、 菌、炭疽芽孢桿菌 大腸埃希菌、百日咳桿菌、軍團(tuán)菌、

42、 支原體真菌 白假絲酵母菌、曲霉菌、毛霉菌,,,,,,,,,,,,合理區(qū)分致病菌,痰及下呼吸道分泌物標(biāo)本易受到上呼吸道正常菌群的污染，細(xì)菌室通?？梢詮乃蜋z的呼吸道標(biāo)本中分離出多種細(xì)菌，但分離細(xì)菌是否能真正代表下呼吸道感染的病原菌，這對(duì)臨床診斷與治療感染性疾病至關(guān)重要。細(xì)菌室人員在檢驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)重視判斷所分離的細(xì)菌是污染的上呼吸道正常菌群還是引起下呼吸道感染的病原菌。對(duì)策：當(dāng)在同一培養(yǎng)基上分離出多種病原菌（復(fù)

43、合菌）時(shí)，應(yīng)主動(dòng)與臨床醫(yī)生聯(lián)系，結(jié)合患者的臨床癥狀、痰涂片染色鏡檢及近期細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果（如近期同一患者多次分離出同一種菌）等綜合判斷所分離的多種細(xì)菌中那一種菌可能是優(yōu)勢(shì)病原菌。當(dāng)分離的優(yōu)勢(shì)菌與涂片染色鏡檢結(jié)果相符時(shí)，優(yōu)勢(shì)菌必須進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。及時(shí)報(bào)告臨床醫(yī)生，合理應(yīng)用抗生素。若分離培養(yǎng)結(jié)果與涂片染色鏡檢結(jié)果不相符時(shí)，應(yīng)在報(bào)告中提示：此結(jié)果請(qǐng)結(jié)合臨床和涂片所見進(jìn)行分析。,表5 痰標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)半定量培養(yǎng)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)及臨床意義,級(jí)別

44、 劃線區(qū)菌落數(shù)目 相當(dāng)菌落數(shù) 臨床意義 第一區(qū) 第二區(qū) 第三區(qū) （cfu/ml） 1+(極少量） 10 10 >5 10 >5 >5 ≥107

45、 多為感染病原菌重復(fù)培養(yǎng)的標(biāo)本也必須是合格標(biāo)本。,,,,,列舉一些常見致病菌菌落形態(tài),痰液：BP：血平板 ；CA：（加入萬(wàn)古霉素 的巧克力平板）； MAC：麥康凱瓊脂平板①G+菌：BP生長(zhǎng)、CA（—）Gram染色：分G+c ,G+ b▲      G+c——依靠溶血特征，菌落形態(tài)、菌落顏色、菌體形態(tài)區(qū)分:葡萄球菌：淡黃色/白色/檸檬色，中等大小，

46、光滑、不透明、較凸，規(guī)則圓形，β/γ溶血，較濕潤(rùn)微球菌：黃色/白色，中等大小，較凸，規(guī)則圓形，不溶血，較干燥，不易乳化鏈球菌：白色、凸起小菌落，β溶血為溶血型鏈球菌；灰白隆起中心扁平或凹陷，1.0-1.5mm大小的寬大а溶血為肺炎鏈球菌；細(xì)如針尖，白色凸起；а溶血的為草綠色鏈球菌腸球菌：灰白，低凸，2.0mm左右之а溶血菌落，較濕潤(rùn)費(fèi)克藍(lán)母菌：灰白凸起小菌落，0.5mm左右大小，а/γ溶血，濕潤(rùn)易乳化口腔球菌：白色凸起較大菌落

47、，不溶血，黏著，接種針挑之則整個(gè)菌落挑起，瓊脂上不留痕跡▲      G+ b——依靠溶血特征，菌落形態(tài)、菌落大小、菌體形態(tài)區(qū)分：棒狀桿菌：白色1.0-1.5mm左右大小，較干燥，不溶血/狹窄β溶血的為白喉或一般棒狀桿菌；小而濕潤(rùn)，灰白/無(wú)色，半透明的為J-K棒狀桿菌；灰白細(xì)小，β溶血的可能為假結(jié)核、化膿放線菌、溶血分泌桿菌；芽孢桿菌：灰白大菌落，表面粗糙如毛玻璃狀，寬

48、大β溶血,列舉一些常見致病菌菌落形態(tài),②G-菌：BP生長(zhǎng)、CA生長(zhǎng)、MAC生長(zhǎng)，Gram染色：G- b—氧化酶▲ 腸桿菌：氧化酶（—），BP上圓形、大而濕潤(rùn)、灰白色、黏液樣、不溶血菌落；MAC上粉紅色或紅色。大腸埃希菌:Mac上粉紅色或紅色，在BP上有些菌株可產(chǎn)生β溶血。肺克：Mac上紅色黏稠狀，菌落中央有氣泡。血瓊脂上灰白色、大而粘、光亮且易形成粘絲的菌落?！?非發(fā)酵菌：一般氧化酶（+），嗜麥芽窄食單胞菌、不動(dòng)桿菌氧化酶（-

49、）；銅綠假單胞菌：BP上扁平、濕潤(rùn)、有金屬光澤，特殊生姜味的綠色或藍(lán)綠色菌落， β溶血嗜麥芽窄食單胞菌：BP上中等大小、圓形、光滑、濕潤(rùn)、產(chǎn)生不溶血的黃色色素。氧化酶（-）不動(dòng)桿菌：球桿狀與G-c不好區(qū)分，BP上菌落圓形、光滑、灰白色、邊緣整齊；溶血不動(dòng)桿菌呈β溶血。氧化酶（-）觸酶（+）NIT（-）BP（-）/細(xì)小、CA生長(zhǎng)，Gram染色：G-b、菌體細(xì)小或呈扭曲之長(zhǎng)絲狀▲  G-苛養(yǎng)菌 流感嗜血桿菌： CA上1

50、~2mm大小菌落，圓形、濕潤(rùn)、光滑、透明或半透明（露滴樣）、無(wú)色至灰白色菌落多為流感嗜血桿菌；灰色略黃，不透明，1.0-1.5mm的多為副流感嗜血桿菌BP（—）、CA（—）、BCYE生長(zhǎng)/或在含有L-半胱氨酸、鐵離子、復(fù)合抗生素選擇劑的強(qiáng)化血瓊脂上生長(zhǎng)—Gram染色：G-b、菌體細(xì)、長(zhǎng)絲狀、生長(zhǎng)緩慢?！?#160;     軍團(tuán)菌：小菌落，灰色，較粘 氧化酶（-）或（±）

51、觸酶（+）BP生長(zhǎng)、CA生長(zhǎng)，Gram染色：G-c——氧化酶（+）、觸酶（+）▲      奈瑟菌：白色/黃色中等大小菌落， 腦膜炎奈瑟菌：直徑1~2mm，灰褐色、光滑、半透明、稍扁菌落?！?#160;     卡他莫拉菌：白色小菌落直徑1~3mm（24h內(nèi)），菌落有脆性，用接種環(huán)推之可在培養(yǎng)基表 面移動(dòng),列舉一些

52、常見致病菌菌落形態(tài),③真菌及奴卡菌：BP、CA、沙氏板均生長(zhǎng)——Gram染色G+，藍(lán)黑色?！?#160;     真菌：中等大小、濕潤(rùn)、黃白色乳酪樣或漿糊樣，生長(zhǎng)快，具有顯著酵母樣氣味的菌落，多數(shù)可在顯色培養(yǎng)基上顯色：綠色、翠綠色為白色假絲酵母菌；藍(lán)灰色、鐵灰色為熱帶假絲酵母菌；紫紅色邊緣模糊有微毛為克柔假絲酵母菌；整個(gè)菌落濕潤(rùn)且紫紅色為光滑球擬假絲酵母菌；白色為無(wú)法鑒定的其他假絲酵

53、母菌?！?#160;     奴卡菌：小菌落，生長(zhǎng)慢，菌落皺褶，呈顆粒狀，有時(shí)產(chǎn)生褐色、黃色、黑色等色素 ；需氧性放線菌。④肺炎支原體：固體培養(yǎng)基上，低倍鏡或解剖顯微鏡下為典型“荷包蛋”樣菌落，在Hayflick雙相培養(yǎng)基的液體中使培養(yǎng)基變黃。,3.肺組織標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn),介入操作獲得的肺組織標(biāo)本很珍貴，細(xì)菌室應(yīng)當(dāng)對(duì)其進(jìn)行大撒網(wǎng)式檢驗(yàn)，即同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌、真菌、分枝桿菌的涂片和培養(yǎng)。穿

54、刺獲得的肺組織常常很少，要提高檢驗(yàn)的陽(yáng)性率，首先應(yīng)當(dāng)對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行研磨。對(duì)于標(biāo)本量少的組織，建議用小號(hào)的研磨器。最好涂片3張，如標(biāo)本量少，也要至少涂片一張。研磨的標(biāo)本可以接種于自動(dòng)化加有抗生素中和劑的需氧或厭氧血培養(yǎng)瓶上機(jī)培養(yǎng)。 每日觀察平板生長(zhǎng)情況或儀器中的生長(zhǎng)曲線。,4.重視直接涂片,直接涂片鏡檢的優(yōu)勢(shì)在于：（1）簡(jiǎn)單快速，通常2~4h可以報(bào)告結(jié)果。而普通細(xì)菌培養(yǎng)鑒定的時(shí)間至少2~3d，真菌和分支桿菌的時(shí)間更長(zhǎng)。因此直接涂片可以

55、快速指導(dǎo)臨床選藥。（2）對(duì)于某些難生長(zhǎng)的細(xì)菌，直接涂片可能是唯一的診斷手段。如肺毛霉菌病，因?yàn)槊咕灰着囵B(yǎng) ，陽(yáng)性率不高。卡氏肺孢子菌無(wú)法體外培養(yǎng)，診斷只能靠直接涂片或PCR技術(shù)。 （3）直接涂片可以為組織培養(yǎng)提供方向。肺組織標(biāo)本常常很少，簡(jiǎn)單的涂片可以讓我們把握培養(yǎng)的重心。 （4）呼吸道標(biāo)本，如痰標(biāo)本，雜菌相對(duì)較多，特別是一些生長(zhǎng)快的細(xì)菌會(huì)掩蓋慢生長(zhǎng)的細(xì)菌導(dǎo)致培養(yǎng)陰性，但涂片可以發(fā)現(xiàn)這些慢生長(zhǎng)的細(xì)菌。 如某肺部空洞患者的

56、黃膿痰標(biāo)本革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)：WBC>25/LP,EP<10/LP，油鏡下發(fā)現(xiàn)較多的假菌絲和孢子，以及一些著色不均的革蘭氏陽(yáng)性絲狀菌（可疑奴卡菌）。24h培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)白色念珠菌遍布整個(gè)平板。此患者口服200mg氟康唑后，再次進(jìn)行培養(yǎng)，平板放置48h培養(yǎng)出奴卡菌。,未來(lái)的方向,快速檢測(cè)和分子檢測(cè)技術(shù)為提高肺部感染診斷的陽(yáng)性率，目前許多快速檢測(cè)技術(shù)如軍團(tuán)菌抗原檢測(cè)、肺炎鏈球菌抗原檢測(cè)、曲霉菌半乳甘露聚糖試驗(yàn)、隱球菌抗原檢測(cè)等已在臨床開