三株紫色非硫細(xì)菌的鑒定及光合色素對環(huán)境因子的響應(yīng).pdf

1、不產(chǎn)氧光合細(xì)菌（Anoxygenic Phototrophic Bacteria，APB）利用各種有機(jī)物或無機(jī)物作為電子供體，在厭氧條件下進(jìn)行光合作用但不釋放氧氣，廣泛分布于自然界各種生態(tài)環(huán)境中。紫色非硫細(xì)菌（purple nonsulfur bacteria，PNSB）是APB的一個(gè)重要類群，具有顯著的高度多樣化和異質(zhì)化生理生態(tài)特性，不僅是闡明光合作用機(jī)理的良好實(shí)驗(yàn)材料，而且在研究光合作用光合機(jī)構(gòu)（包括光合色素和色素蛋白復(fù)合體）環(huán)境適

2、應(yīng)性調(diào)控機(jī)制方面具有典型性，雖已有較廣泛的研究，但深入挖掘獨(dú)特生境中的PNSB資源并進(jìn)行其特性研究仍具有重要意義。
　　本文從新疆布爾津鹽成土壤、新疆天山天池和大同煤礦集團(tuán)馬脊梁礦井酸性環(huán)境取樣，采用選擇性培養(yǎng)基純化獲得了3種紫色非硫細(xì)菌，包括耐鹽Rhodobacter capsulatus XJ-1（新疆鹽成土壤），耐鹽Rhodobacter sphaeroides TS（新疆天池），耐硫化物Rhodopseudomonas p

3、alustris98144（大同煤礦酸性環(huán)境）。在對這三株菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性測定、16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析基礎(chǔ)上，采用紫外-可見光譜法（UV-Vis）、高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法（TLC）、LC/MS和圖像灰度分析等方法，重點(diǎn)研究了環(huán)境因子光、氧、鹽度、砷（As）、pH、乙酸對菌株合成的光合色素含量和組分的影響。這為深入了解特殊生境PNSB的適應(yīng)性機(jī)制及其在生態(tài)系統(tǒng)中的作用提供了重要參考，也

4、為深入開展APB光合色素環(huán)境適應(yīng)性調(diào)控分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，在環(huán)境砷檢測、凈化煤礦礦坑水、色素開發(fā)方面也具有一定的應(yīng)用潛力。主要研究結(jié)果如下：
　　1.采用改良的Ormerod培養(yǎng)基和瓊脂振蕩稀釋法從新疆鹽成土壤樣品中分離獲得了XJ-1菌株，該菌株的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞呈鋸齒狀排列和大多數(shù)碳、氮源利用能力等特性與Rhodobacter capsulatus非常相似，二者在系統(tǒng)進(jìn)化樹上位于同一進(jìn)化分支。菌株XJ-1生長不需要NaCl，但

5、在0-0.4 mol/L鹽度范圍內(nèi)生長良好。在光照厭氧條件下，亞砷酸鹽[As(III)]和砷酸鹽[As(V)]對菌株XJ-1的半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）分別為0.61 mmol/L和2.03 mmol/L，XJ-1能夠?qū)s(V)還原為As(III)，不能將As(III)轉(zhuǎn)化為As(V)或其它有機(jī)態(tài)砷化物。在生境、耐低溫、生長因子需求、甘油、硝酸鹽和硫代硫酸鈉利用能力、耐鹽性及對As的耐受性等方面，菌株XJ-1不同于已報(bào)道菌株，因而將其鑒

6、定為莢膜紅細(xì)菌（Rhodobacter capsulatus）的一個(gè)新菌株。
　　2.以XJ-1為研究對象，研究了光和氧對細(xì)菌葉綠素（bacteriochlorophyll，BChl）和類胡蘿卜素（carotenoid，Car）合成的影響。結(jié)果表明：光照厭氧條件下，菌體積累的BChl和Car含量最高，氧的存在抑制了色素的合成。在光照厭氧、光照好氧和黑暗好氧條件下，菌體只積累一種BChl a，相對含量分別占總色素含量的44.61％、

7、74.89%和77.53%。光照好氧條件下，細(xì)胞還積累一種新的紫色色素，特征峰為355 nm、389 nm、520 nm、621 nm和755 nm。在光照厭氧和黑暗好氧條件下，細(xì)胞不積累此紫色色素。球形烯（spheroidene，SE）和羥基球形烯（OH-spheroidene，OH-SE）是光照厭氧下細(xì)胞積累的主要Car，生長于黑暗好氧條件下的培養(yǎng)物，除了積累球形烯酮（spheroidenone, SO）外，還積累羥基球形烯酮（OH

8、-spheroidenone，OH-SO）。菌株XJ-1是研究特殊生境APB BChl合成基因表達(dá)調(diào)控的一個(gè)良好菌株。
　　以XJ-1為研究對象，研究了光照厭氧條件下NaCl對菌體生長、Car和BChl合成的調(diào)控作用。結(jié)果表明：0-0.2 mol/L NaCl范圍內(nèi)，隨鹽度增加，菌體生長速率、最終生物量以及菌體積累的BChl和Car含量升高，繼續(xù)增加鹽度，菌體的生長速率、最終生物量以及菌體積累的BChl和Car含量又逐漸降低。未添

9、加NaCl時(shí)，菌體細(xì)胞主要積累5種色素組分，分別為BChl a、脫鎂細(xì)菌葉綠素（bacteriopheophytin， BPhe）、SE、SO和OH-SE；但當(dāng)添加0.2-0.4 mol/L NaCl時(shí)，菌體額外積累了一種BPhe組分。隨NaCl濃度增加，菌體積累的BChl a和SE的相對含量降低，2種BPhe組分的相對含量則增加，而OH-SE和SO則呈先升后降的趨勢。由此可見，隨著鹽度的變化，菌體光合色素的積累量與菌體的生長相關(guān)聯(lián)，光

10、合色素的組分和相對含量也隨之發(fā)生了規(guī)律性的變化。本結(jié)果為深入開展APB光合色素鹽適應(yīng)性機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。
　　以菌株XJ-1為研究對象，研究了As對細(xì)胞積累的光合色素組分和相對含量的影響。當(dāng)As(III)濃度為0-0.2 mmol/L時(shí)，隨著濃度增加，菌體積累的BChl和Car含量逐漸升高，0.2 mmol/L As(III)時(shí)，達(dá)到最大值；若繼續(xù)增加濃度，菌體積累的BChl和Car含量則逐漸降低。當(dāng)As(V)濃度為0-0.5

11、mmol/L時(shí)，隨著濃度增加，菌體積累的BChl和Car含量略微升高，若繼續(xù)增加濃度，菌體積累的BChl和Car含量則逐漸降低。Tetrahydrogeranylgeranyl BChl a（ BChl aTHGG）、phytylated BChl a（BChl ap）、SE和 SO是主要積累色素。當(dāng)環(huán)境中存在As時(shí)，BChl aTHGG與BChl aP、SO與 SE的相對比例會(huì)發(fā)生改變，OH-SE未被檢測到。當(dāng)細(xì)胞生長在0.5 mmo

12、l/L As(V)和0.2 mmol/L As(III)環(huán)境中，BPhe也未被檢測到。結(jié)果表明，菌株XJ-1積累的光合色素對As(V)和As(III)敏感，并且As濃度對色素的合成有明顯影響。這種變化使得XJ-1可作為特殊生境APB光合色素基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究的良好菌株，也有用于檢測環(huán)境中As的潛在價(jià)值。
　　以XJ-1為研究對象，研究了光照厭氧條件下乙酸對菌體生長、細(xì)胞積累的Car和BChl組分和相對含量的影響。結(jié)果表明：在2-

13、24 g/L乙酸濃度范圍內(nèi)，隨著乙酸濃度變化，菌體積累色素的組分和相對含量也隨之發(fā)生了規(guī)律性變化。當(dāng)乙酸濃度為6 g/L時(shí)，菌體細(xì)胞積累的Car和BChl量達(dá)到最大。高濃度乙酸抑制BPhe的合成，低濃度下，積累一種或兩種BPhe。當(dāng)乙酸濃度增至6 g/L和8 g/L，菌體積累的OH-SO才被檢測到。在不同濃度乙酸中，細(xì)胞只積累一種BChl a。該菌株可以用于處理富含乙酸的有機(jī)廢水，同時(shí)生產(chǎn)單一的BChl a。
　　3.采用改良的O

14、rmerod培養(yǎng)基HP83，從新疆天山天池中分離到菌株TS，在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞產(chǎn)生粘液和大多數(shù)碳、氮源利用能力等特性方面，TS與Rhodobacter sphaeroides很相似，二者在系統(tǒng)進(jìn)化樹中也位于同一進(jìn)化分支。然而，菌株TS在生境、吸收光譜、生長因子、最適pH、溫度范圍方面不同于已報(bào)道菌株，因而將菌株TS鑒定為Rhodobacter sphaeroides的一個(gè)新菌株。
　　光照厭氧條件下，該菌株在376 nm、423 n

15、m、453 nm、480 nm、508 nm、592 nm、802 nm和854 nm處有吸收峰，在874-877 nm處有橢峰，表明含有BChl a和球形烯Car。不同碳源、氮源、pH值和不同濃度的NaCl對活細(xì)胞的特征吸收峰有影響，尤其會(huì)引起423 nm處特征吸收峰和874-877 nm處駝峰的變化。
　　菌體積累的Car和BChl的含量隨pH增加而略有增加。當(dāng)環(huán)境pH為6.5和8.0時(shí)，菌體細(xì)胞積累的BChl a的相對含量分

16、別占總色素量的55.46%和55.43%，菌體細(xì)胞積累的BPhe和Car各組分的相對含量，受pH影響相對明顯。在光照厭氧條件下，SE和SO是Rhodobacter sphaeroides積累的主要Car組分。有趣的是，菌株TS未積累SO。細(xì)胞積累的光合色素不僅是APB受環(huán)境調(diào)控的結(jié)果，也是細(xì)胞內(nèi)生理代謝的綜合體現(xiàn)。菌株TS積累的光合色素不同于已報(bào)道菌株，該菌株對不同pH的響應(yīng)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。
　　4.采用改良的Pfenni

17、g1988無機(jī)選擇性培養(yǎng)基，從酸性環(huán)境中分離獲得了菌株98144。硫化物耐受能力測定表明，菌株98144能生長于含有0-6 mmol/L Na2S的環(huán)境中，在1.5 mmol/L Na2S環(huán)境中，獲得的菌體生物量最大，表明對硫化物有較強(qiáng)的耐受能力。菌株98144在亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉和硫環(huán)境中，生長良好。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，菌株98144與Rhodopseudomonas palustris ATCC l7001親緣關(guān)系最近，但二者在吸收光

18、譜、碳源和硫源利用方面存在差別，所以菌株98144被鑒定為Rhodopseudomonas palusteris的一個(gè)新菌株。TLC分析表明，在光照厭氧條件下，1.5 mmol/L Na2S環(huán)境中，該菌株積累4種正常螺菌黃素系列Car，一種BPhe和一種BChl a，且BChl a相對含量占總色素量的65.66%，含量高。如果進(jìn)一步研究，菌株98144可用于凈化煤礦礦坑水，同時(shí)提取BChl a制品，也可以作為研究PNSB對硫化物和亞硫酸