抗原修復方法及注意事項

1、檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復法(強烈推薦)1.適用范圍：適合于大量中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復，其效果優(yōu)于微波修復法和直接煮沸修復法使得免疫組化結果更加可靠2.儀器設備：市售不銹鋼家用壓力鍋，大小尺寸可根據(jù)需要而定(內(nèi)徑18cm為好)；10001500W電爐一臺；不銹鋼或耐高溫塑料切片架。3.所需試劑：0.01M檸檬酸型緩沖液，pH=6.00.14.操作步驟：(1)常規(guī)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，浸泡于蒸餾水中

2、待用。(2)取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液(8001500ml)于壓力鍋中，大火加熱直至沸騰；將脫蠟水化后的組織切片置于不銹鋼或耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中。蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴汽，從噴汽開始計時，12分鐘后，壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫(稍冷后，可在自來水籠頭下加速冷卻)，取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS(pH=7.27.4)沖洗兩次，每次3分鐘(23)。(3)按有關試劑盒的操作步驟執(zhí)行。5.注意

3、事項：(1)加熱時間長短的控制很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋離開火源的總時間控制在58分鐘為好，時間過長可能會使染色背景加深。(2)必須使用不銹鋼或耐高溫塑料切片架，不能使用銅架，以防緩沖液pH值增高而導致掉片。(3)高壓鍋離開火源后必須等緩沖液冷切后，才能把切片取出。(4)為防止組織脫落，玻片必須經(jīng)清潔處理后，涂覆PolyLLysine((5)緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復使用。EDTA抗原熱修

4、復法1.適用范圍：適用于部分中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復。2.儀器設備：電磁爐、不銹鋼鍋和耐高溫塑料染色架。3.所需試劑：EDTA抗原修復液，pH9.04.操作步驟：(1)抗原修復液的配制：根據(jù)所需工作液的量，取邁新公司產(chǎn)品MVS0098適量，按1:50的比例稀釋。(2)取500ml抗原修復工作液于1000ml不銹鋼鍋中，直接在電磁爐上加熱至沸騰后，調(diào)低電磁爐功率使鍋內(nèi)修復液保持微沸狀態(tài)。將組織切片置于耐高溫染色架上，再

5、將染色架緩慢放入不銹鋼鍋中(注意：若快速將染色架丟進緩沖液中，往往會導致瞬時的激烈沸騰現(xiàn)象而造成組織脫落)，之后加蓋繼續(xù)加熱20分鐘。再將不銹鋼鍋從電磁爐上移開，室溫下自然冷卻至室溫后取出切片，蒸餾水洗1次3分鐘，PBS洗2次、每次3分鐘。之后進行免疫組化染色。5.注意事項：(1)由于修復液蒸發(fā)量無法估計，所以修復液不能重復使用。由于修復液蒸發(fā)量無法估計，所以修復液不能重復使用。(2)工作液的量必須保證切片始終能浸泡在液體內(nèi)。(3)為了

6、防止加熱過程組織脫片，須采用PolyLLysine處理載玻片。(4)抗原修復后一定要等工作液冷卻后，才能將切片從工作液中取出。檸檬酸緩沖液微波抗原修復法1.適用范圍：適合于大量中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復，其效果比高溫高壓修復差但比直接水煮好。2.儀器設備：微波爐(700800w)。也就是說當我們修復時的溫度越低則需要修復的時間就會越長；反過來當修復溫度增高時則修復的時間可以適當?shù)乜s短，才能使抗原決定簇完全暴露，這種反比

7、的關系從MBI單克隆抗體的實驗結果表一中也可以清楚地看出。如果修復強度不夠，免疫組織化學染色所顯示的只能是修復后暴露出的部分抗原決定簇，而不是組織所含的全部抗原。這樣的染色結果可能會非常弱，或出現(xiàn)假陰性，即使是陽性結果，充其量只能起到定性的作用，不能適應今后對免疫組化進行定量的需要2、組織固定時間和所需的抗原熱修復的關系固定時間越長的標本，它所形成的橋連就越緊密，抗原就越難以被激活，所需要的修復強度也就越強。有意思的是隨著固定時間的延長

8、，組織中蛋白對溫度的耐受也會相應增高，這可能就是我們對固定時間長的標本加大修復強度的理論基礎。這就提醒我們在做回顧性研究時一定要注意所使用的修復條件，它與新鮮標本的修復條件一定是有所區(qū)別的，同等條件下一定要加長修復的時間或提高修復所使用的溫度，才可能得到比較滿意的結果。3、不同pH值抗原修復液對染色結果的影響抗原熱修復中所使用的修復液pH值也會對染色結果產(chǎn)生相當大的影響。pH值對染色結果的影響大概可以分為以下四種情況。A—穩(wěn)定型，pH值

9、對染色結果的影響不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等。B—V型，高pH值和低pH值染色較好，而pH值46染色結果較差，如ER、Ki67等。C—上升型，隨著pH值的增加，染色結果逐漸增強，如HMB45等。D—下降型，隨著pH值的增加，染色結果逐漸減弱，當然這種類型的抗體只是個別的現(xiàn)象，如MOC31。一個有趣的現(xiàn)象值得注意，即在高pH值（約pH8.0~9.0），A、B、C三者都有較好的染色結果，所以目前比較推崇的抗原修復液為高pH值

10、的修復液，如1mMEDTApH8.0或pH9.0等。但是由于傳統(tǒng)習慣，絕大多數(shù)醫(yī)院和實驗室都在使用pH6.0的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床工作的實際情況，許多國外免疫組化專家建議，在常規(guī)的免疫組化工作中，全部選用高pH值的修復液來代替目前廣為使用的pH6.0枸櫞酸緩沖液。為此，本公司已經(jīng)推出pH8.0和pH9.0的新型抗原修復液。經(jīng)驗證，絕大多數(shù)的抗體使用pH9.0的修復液效果都要優(yōu)于pH6.0的枸櫞酸，尤其是核

11、陽性的抗體。所以，在常規(guī)的免疫組化工作中，使用高pH值的抗原修復液是今后的必然趨勢。4、抗原熱修復的手段目前抗原熱修復所采用的方法主要有微波爐修復和高壓鍋修復兩種。高壓修復具有溫度均一、節(jié)省時間、效果穩(wěn)定等特點。5、抗原熱修復具體操作過程可根據(jù)實驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復?？乖瓱嵝迯涂蛇x用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以1mM的EDTA抗原修復液（pH8.0或pH9.