角蛋白降解菌地衣芽孢桿菌CP--16脂類水解酶的研究.pdf

1、家禽羽毛富含角蛋白是一種豐富的蛋白質(zhì)資源，因其組成與結(jié)構(gòu)的特殊性難于被動物消化利用。羽毛表層覆蓋致密的疏水脂質(zhì)層，形成羽毛與外界環(huán)境物質(zhì)接觸的屏障。內(nèi)層為富含大量二硫鍵、氫鍵、疏水基團，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不易降解的角蛋白。破壞羽毛表層脂質(zhì)，增加蛋白酶與角蛋白結(jié)合，可加快羽毛降解速度。本論文通過對羽毛高效降解菌株地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）CP-16脂類水解酶對羽毛表層脂質(zhì)水解的研究，探究脂類水解酶與角蛋白酶協(xié)同關(guān)系及其在微生物

2、降解角蛋白中的作用。
　　B.licheniformis CP-16脂類水解酶基因在大腸桿菌中表達。在Uniprot中搜集B.licheniformis中脂類水解酶的3個酶蛋白核酸序列，根據(jù)序列設(shè)計引物，以B.licheniformis CP-16基因組DNA為模板，擴增脂類水解酶基因L-4，L-6，L-7，大小分別為747bp，783 bp，897bp。成功構(gòu)建載體pET-22b-L-4、pET-22b-L-6、pET-22b-

3、L-7。在大腸桿菌中表達、純化，獲得3種重組酶蛋白。
　　重組酶L-4、L-6、L-7酶學性質(zhì)研究。重組酶L-4的最適pH為6.5，最適溫度為50℃，在pH6.5～9.5、溫度低于55℃的范圍內(nèi)酶活穩(wěn)定，F(xiàn)e2+、Na+、Mn2+、Ca2+(10 mmol/L)對其活性有促進作用。該酶在甲醇和二甲基亞砜(DMSO)中保存，活性可保留85％、97％，但其它有機溶劑的抑制作用明顯。重組酶L-6的最適pH為7.5，最適溫度為45℃，pH

4、穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性相對較差，Zn2+、Cu2+、Fe3+(10 mmol/L)對酶活性有明顯的抑制作用，其他金屬離子對酶活性無影響。該酶在甲醇和DMSO中活性可保留69％、61％。重組酶L-7的最適pH為6.0，最適溫度為50℃，pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性均與L-4基本一致，F(xiàn)e2+、Mg2+、Mn2+、Ba2+(10 mmol/L)對酶活性具有促進作用，在DMSO中活性無損失。
　　脂類水解酶基因L-4、L-7在巴斯德畢赤酵母(Pi

5、chia pastoris)中的表達及其應(yīng)用。對兩種酶學性質(zhì)較好的脂類水解酶基因進行優(yōu)化，構(gòu)建了野生型(pPICZαA-PL-4、pPICZαA-PL-7)和優(yōu)化型(pPICZαA-PL-4-opt、pPICZαA-PL-7-opt)4種質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacⅠ線性化后電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母X-33。優(yōu)化后二者酶活分別提高了38.09％,12.16％。對優(yōu)化后重組酶PL-4-opt，PL-7-opt制備凍干粉，酯酶酶活分別為1.42 U/