地衣芽孢桿菌普魯蘭酶編碼基因的克隆與表達(dá).pdf

1、普魯蘭酶(EC.3.2.1.41)是一種能夠?qū)Ｒ恍郧虚_支鏈淀粉分支中的α-1，6-糖菅鍵，從而剪下整個(gè)側(cè)支，形成支鏈淀粉的解支酶。它在淀粉加工工業(yè)中有著非常重要的用途，可以大規(guī)模的提高淀粉的利用率和生產(chǎn)效率。普魯蘭酶可以單獨(dú)使用，亦可以與其它酶配合使用，當(dāng)前較成熟地應(yīng)用于高葡糖漿，高麥芽糖漿和干啤酒生產(chǎn)中。普魯蘭酶的水解性質(zhì)決定了它具有提高淀粉質(zhì)原料利用率、降低糧耗的作用，因此它在淀粉加工工業(yè)中有著重要的用途和良好的市場(chǎng)前景。地衣芽孢桿

2、菌的全基因組序列已在2004年被公布，對(duì)基因組序列分析顯示，其中有一段大小為2133bp的片段可能編碼普魯蘭酶基因，并被標(biāo)注為amyX。多年來(lái)，地衣芽孢桿菌作為外源基因表達(dá)宿主被用于包括普魯蘭酶在內(nèi)的多種外源蛋白的表達(dá)，但有關(guān)地衣芽孢桿菌自身產(chǎn)生的普魯蘭酶及其基因則國(guó)內(nèi)外均未見實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。 本論文以PCR方法從地衣芽孢桿菌染色體DNA中擴(kuò)增出amyX基因蛋白編碼區(qū)，插入大腸桿菌表達(dá)載體pET28aT7啟動(dòng)子下游。經(jīng)普魯蘭酶活性

3、檢測(cè)、SDS-PAGE及大腸基因組DNA的PCR擴(kuò)增分析表明，普魯蘭酶基因在BL21(DE3)中得到了正確的表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵時(shí)，檢測(cè)到的酶活大約為5.6U/mL。重組工程菌連續(xù)轉(zhuǎn)接5代后，經(jīng)接種培養(yǎng)、誘導(dǎo)發(fā)酵及PCR反應(yīng)鑒定表明具有良好的遺傳穩(wěn)定性。 重組菌所產(chǎn)的普魯蘭酶分子量約為80kD左右；重組酶的最適作用溫度范圍為35℃～45℃，在pH6.0條件下，30℃～50℃之間酶活性變化不大；最適作用pH范圍為5.5～6.5，在溫

4、度為40℃時(shí)，有較廣泛的pH穩(wěn)定范圍，pH為5.0～7.0范圍內(nèi)，該酶都具有較高的活性；該酶具有很好的熱穩(wěn)定性，40℃保溫64h仍有40％的殘余酶活。該酶反應(yīng)不需要金屬離子的參與，但是很多離子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Fe2+、Cd2+和Pb2+對(duì)該酶有不同程度的抑制作用；添加Mg2+和Ca2+對(duì)酶活性有不同程度的促進(jìn)作用；而添加K+、Na+、Li+、Ni2+和Ba2+對(duì)該酶無(wú)明顯的激活或抑制作用；5×10-3m

5、ol/L的SDS使酶完全失活，這可能是由于該普魯蘭酶分子中缺乏二硫橋結(jié)構(gòu)的緣故。 對(duì)重組菌的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，采取了單因素試驗(yàn)分別考察了不同的氮源、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、培養(yǎng)溫度、初始pH、裝液量、接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響。得到了產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基：酵母膏1％，蛋白胨1％，NaCl1％，K2HPO40.017％，MgSO4·7H2O0.012％，MnSO4·7H2O0.012％；產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)條件：培養(yǎng)3h后誘導(dǎo)，培養(yǎng)溫度為20℃，培養(yǎng)基的p