精惡唑禾草靈降解菌的分離、降解特性研究及其水解酶基因feh的克隆與表達.pdf

1、精惡唑禾草靈屬于芳氧苯氧丙酸酯類除草劑，廣泛應(yīng)用于禾本科雜草的防除，目前在我國有較廣的應(yīng)用范圍。精惡唑禾草靈在土壤中的殘留會對生態(tài)環(huán)境和后茬作物產(chǎn)生不良影響。以微生物降解為基礎(chǔ)的生物修復(fù)在消除有機污染方面具有重要作用，一直得到研究人員廣泛的關(guān)注。
　　 本研究從長期使用精惡唑禾草靈的土壤中分離篩選到一株精惡唑禾草靈降解菌，根據(jù)其表型特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列相似性分析，將其鑒定為Rhodococcus sp.J

2、PL-2。
　　 菌株JPL-2在pH5.0-9.0范圍內(nèi)生長良好，最適生長pH為7.0;最適生長溫度為30℃;好氧性生長;最適生長碳氮源分別為果糖和牛肉膏;在NaCl為0-20 g·L-1的濃度范圍內(nèi)生長良好;對卡那霉素有抗性。
　　 菌株JPL-2能夠在以精惡唑禾草靈為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中生長，并在60 h內(nèi)對100 mg·L-1精惡唑禾草靈的降解率為94.5％;菌株JPL-2對精惡唑禾草靈的最適降解溫度為30℃

3、;最適降解pH為7.0;降解速率與接種量成正相關(guān);精惡唑禾草靈的初始濃度越高，所需的降解時間越長。
　　 運用鳥槍法構(gòu)建菌株JPL-2基因組DNA文庫，克隆到一個精惡唑禾草靈水解酶基因，命名為feh。該基因大小為1140個堿基，編碼380個氨基酸。通過在線比對同源性，該基因與Rhodococcus sp.T1中羧酸酯酶基因(GenBank accession No.JF970231)的序列相似性為77％。以pET29a為表達載體

4、，構(gòu)建表達質(zhì)粒pET29a-feh，實現(xiàn)了FEH蛋白在E.coliBL21(DE3)中的融合表達，并通過鎳離子親和層析的方法純化得到了融合蛋白FEH。
　　 對FEH進行酶學(xué)特性研究，結(jié)果表明:FEH在10℃-40℃之間均具有較高的穩(wěn)定性，在pH7.5，35℃時活性最高;在1 mmol·L-1的濃度條件下，F(xiàn)EH除對Ni2+，Hg2+，Ag+三種離子敏感外，其它金屬離子如Fe2+，Cu2+，Mg2+，Al3+等對其活性沒有明顯影