精惡唑禾草靈降解菌的分離、降解特性研究及其水解酶基因feh的克隆與表達(dá).pdf

1、精惡唑禾草靈屬于芳氧苯氧丙酸酯類除草劑，廣泛應(yīng)用于禾本科雜草的防除，目前在我國(guó)有較廣的應(yīng)用范圍。精惡唑禾草靈在土壤中的殘留會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和后茬作物產(chǎn)生不良影響。以微生物降解為基礎(chǔ)的生物修復(fù)在消除有機(jī)污染方面具有重要作用，一直得到研究人員廣泛的關(guān)注。
　　 本研究從長(zhǎng)期使用精惡唑禾草靈的土壤中分離篩選到一株精惡唑禾草靈降解菌，根據(jù)其表型特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列相似性分析，將其鑒定為Rhodococcus sp.J

2、PL-2。
　　 菌株JPL-2在pH5.0-9.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，最適生長(zhǎng)pH為7.0;最適生長(zhǎng)溫度為30℃;好氧性生長(zhǎng);最適生長(zhǎng)碳氮源分別為果糖和牛肉膏;在NaCl為0-20 g·L-1的濃度范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好;對(duì)卡那霉素有抗性。
　　 菌株JPL-2能夠在以精惡唑禾草靈為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并在60 h內(nèi)對(duì)100 mg·L-1精惡唑禾草靈的降解率為94.5％;菌株JPL-2對(duì)精惡唑禾草靈的最適降解溫度為30℃

3、;最適降解pH為7.0;降解速率與接種量成正相關(guān);精惡唑禾草靈的初始濃度越高，所需的降解時(shí)間越長(zhǎng)。
　　 運(yùn)用鳥(niǎo)槍法構(gòu)建菌株JPL-2基因組DNA文庫(kù)，克隆到一個(gè)精惡唑禾草靈水解酶基因，命名為feh。該基因大小為1140個(gè)堿基，編碼380個(gè)氨基酸。通過(guò)在線比對(duì)同源性，該基因與Rhodococcus sp.T1中羧酸酯酶基因(GenBank accession No.JF970231)的序列相似性為77％。以pET29a為表達(dá)載體

4、，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET29a-feh，實(shí)現(xiàn)了FEH蛋白在E.coliBL21(DE3)中的融合表達(dá)，并通過(guò)鎳離子親和層析的方法純化得到了融合蛋白FEH。
　　 對(duì)FEH進(jìn)行酶學(xué)特性研究，結(jié)果表明:FEH在10℃-40℃之間均具有較高的穩(wěn)定性，在pH7.5，35℃時(shí)活性最高;在1 mmol·L-1的濃度條件下，F(xiàn)EH除對(duì)Ni2+，Hg2+，Ag+三種離子敏感外，其它金屬離子如Fe2+，Cu2+，Mg2+，Al3+等對(duì)其活性沒(méi)有明顯影