Locostatin對(duì)肝星狀細(xì)胞膠原代謝的影響.pdf

1、肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell HSC)是ECM的主要來源，正常情況下肝星狀細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。HSC表現(xiàn)為富含維生素A脂滴的靜止型，基本功能主要有:①代謝和貯存維生素A，②儲(chǔ)存脂肪，③合成和分泌膠原及糖蛋白、蛋白多糖等基質(zhì)成分，④合成基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase MMPs)及其組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloprot-einases，TIMPs)

2、，⑤表達(dá)細(xì)胞因子及受體，⑥參與肝竇血流調(diào)節(jié)。當(dāng)肝臟受到炎癥或機(jī)械刺激等損傷時(shí)，肝星狀細(xì)胞被激活，其表型由靜止型轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ钚?。肝星狀?xì)胞激活后可以分泌和增生細(xì)胞外基質(zhì)，通過這點(diǎn)參與肝纖維化的形成并重建肝內(nèi)結(jié)構(gòu)，此外還可以提升肝竇內(nèi)的壓力。當(dāng)受到一些物理或化學(xué)刺激后，HSC激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(myofibroblast cells，MFC)，各種致纖維化因素均把HSC作為最終靶細(xì)胞。
　　肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是

3、肝星狀細(xì)胞的持續(xù)激活，當(dāng)肝星狀細(xì)胞被激活后可以增生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)。肝星狀細(xì)胞激活后轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(MFC)，各種致HSC位于Disse間隙內(nèi)，緊貼著肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(sinusoidal endothelial cells，SEC)和肝細(xì)胞。其形態(tài)不規(guī)則，胞體呈圓形或不規(guī)則形，常伸出數(shù)個(gè)星狀胞突包繞著肝血竇。分泌出的細(xì)胞外基質(zhì)會(huì)參與肝內(nèi)結(jié)構(gòu)的重建并且促進(jìn)肝纖維化的形成。肝星狀細(xì)胞的激活過程十分復(fù)雜，包括兩個(gè)主要階段:啟動(dòng)階段及持

4、續(xù)階段。此外，肝星狀細(xì)胞激活后可以使肝竇內(nèi)壓升高也是肝纖維化的病理基礎(chǔ)。持續(xù)階段則是這些刺激因素維持肝星狀細(xì)胞的活化表型，結(jié)果引起肝纖維化形成。
　　膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成份，在發(fā)生肝纖維化時(shí)人體內(nèi)膠原比正常時(shí)增加5-7倍，其中以Ⅰ、Ⅲ型增加為主，Ⅰ型膠原較Ⅲ型膠原增加明顯，含量達(dá)60％-70％。激活的肝星狀細(xì)胞能表達(dá)出成纖維細(xì)胞的特征，其胞質(zhì)中維生素A減少甚至缺乏，細(xì)胞收縮生成膠原纖維。細(xì)胞核內(nèi)膠原相關(guān)遺傳信息經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯、修

5、飾后形成a肽鏈，每三條a肽鏈相互結(jié)合擰成三條螺旋狀結(jié)構(gòu)，成為前膠原，前膠原在細(xì)胞內(nèi)合成后被分泌到細(xì)胞外間隙形成不溶性膠原。膠原降解主要由膠原酶參與降解，它能在生理PH和溫度條件下特異性水解天然膠原蛋白三維螺旋結(jié)構(gòu)，而不損傷其他蛋白質(zhì)和組織。
　　Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RK IP)是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族(phosphatidylethanolalmine-binding p

6、roteins，PEBPs)的成員之一，廣泛存在于不同種屬，參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。RKIP是在信號(hào)通路Raf-1/MEK/ERK1，2中起負(fù)向調(diào)節(jié)作用的因子，但是RKIP過表達(dá)可以增強(qiáng)HSC的遷移能力Locostatin是一種無抗菌作用的黃惡唑酮衍生物，是RKIP的特異性抑制劑，可以顯著抑制HSC的遷移。可以選用肝星狀細(xì)胞株LX-2，研究TGF-β1刺激后Locostatin對(duì)HSC膠原代謝酶MMPs和TIMPs分泌的影響，以評(píng)估

7、Locostatin在肝纖維化治療中是否具有應(yīng)用的可能。
　　目的:研究TGF-β1刺激后Locostatin對(duì)HSC膠原代謝酶MMPs和TIMPs分泌的影響，將就Locostatin是否可以促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)進(jìn)行研究。
　　方法:通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析TypeⅠ collagen、TypeⅢcollagen、TypeⅣ collagen、MMP-1、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2、MMP-7及GAPDH

8、DNA的表達(dá)。運(yùn)用酶聯(lián)免疫法(ELISA)分析TypeⅠ collagen、MMP-1、TIMP-1。通過western blot方法分析TypeⅠ collagen、MMP-1、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2、MMP-7、MMP-9及GAPDH蛋白的表達(dá)
　　結(jié)果:(1) western blot檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)情況，與control組相比，Locostatin組Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)減少(1.377±0.032 vs

9、1.252±0.007)，P＜0.05，與control組相比，TGF-β1組及TGF-β1+Locostatin組均無差異。western blot檢測(cè)，與control組相比，MMP-1、TIMP-1在TGF-β1、TGF-β1+Locostatin、Locostatin組表達(dá)明顯增加。各組MMP-1/TIMP-1蛋白表達(dá)與control組相比無明顯差異。western blot檢測(cè):與control組相比，TGF-β1組MMP-2

10、蛋白的表達(dá)明顯增加(1.102±0.002 vs1.123±0.002)，P＜0.05;與control組相比，TGF-β1、TGF-β1+Locostatin、locostatin組TIMP-2蛋白的表達(dá)明顯增加。TGF-β1+Locostatin MMP-2/TIMP-2與control組相比，蛋白的表達(dá)明顯降低(1.135±0.002 vs1.101±0.004)，P＜0.05; western blot檢測(cè):與control組相

11、比，TGF-β1、TGF-β1+locostatin組MMP-7蛋白的表達(dá)明顯減少。western blot檢測(cè):與control組相比，TGF-β1、TGF-β1+locostatin、locostatin組MMP-9蛋白的表達(dá)明顯減少。(2) RT-PCR結(jié)果顯示:Locostatin組Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)明顯減少(1.000±0.015 vs0.083±0.034)，P＜0.05;與control組相比，TGF-β1組及TGF-

12、β1+Locostatin組均無差異。RT-PCR檢測(cè):與control組相比，TGF-β1組Ⅲ、Ⅳ型膠原mRNA的表達(dá)明顯增加;與control組相比，Locostatin組Ⅲ、Ⅳ型膠原mRNA的表達(dá)明顯減少，與control組相比，TGF-β1+Locostatin組無明顯差異。RT-PCR檢測(cè)，與control組相比，MMP-1、TIMP-1在TGF-β1、 TGF-β1+Locostatin、Locostatin組mRNA表達(dá)明

13、顯增加。各組MMP-1/TIMP-1表達(dá)與control組相比無明顯差異。RT-PCR檢測(cè):與control組相比，TGF-β1組MMP-2 mRNA的表達(dá)明顯增加(0.976±0.034 vs1.094±0.002)，P＜0.05;與control組相比，TGF-β1、TGF-β1+Locostatin、locostatin組TIMP-2 mRNA的表達(dá)明顯增加。TGF-β1+Locostatin MMP-2/TIMP-2與contr

14、ol組相比，mRNA的表達(dá)明顯降低(0.9103±0.050 vs0.722±0.016)。(3)enzyme-linked immuno sorbent assay結(jié)果顯示，Locostatin組Ⅰ型膠原的表達(dá)減少(0.148±0.006 vs0.111±0.058)，P＜0.05，與control組相比，TGF-β1組及TGF-β1+Locostatin組均無差異。與control組相比，MMP-1、TIMP-1在TGF-β1、 T