間充質(zhì)干細胞移植抑制肝星狀細胞治療肝纖維化的實驗研究.pdf

1、背景：肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導致肝內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)過度沉積的病理過程。許多慢性肝臟疾病最終均發(fā)展為肝纖維化及肝硬化。在肝纖維化進程中，肝星狀細胞的活化是關(guān)鍵事件。膠原纖維等細胞外基質(zhì)多是由肝星狀細胞活化而成的肌成纖維細胞產(chǎn)生的。一般認為肝星狀細胞有四種狀態(tài):原始靜止的肝星狀細胞、激活的肝星狀細胞、靜止的肌成纖維細胞、衰老凋亡的肝星狀細胞。有學者提出抗肝纖維化的主要策略包括誘導肌成纖維細胞凋亡、維持細胞靜止

2、表型或抑制細胞活化等。但迄今為止，臨床上尚無確切有效的抑制肝星狀細胞的抗纖維化藥物，肝纖維化仍缺乏有效治療手段。間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是來源于中胚層的一類成體多能干細胞，除具有自我增殖和多向分化等干細胞特性外還具有免疫調(diào)節(jié)、靶向歸巢、靶向抗炎、主動適應并改造微環(huán)境等生物學特性，使MSC適用于多種組織修復治療。研究表明MSC對缺血性心肌梗死引起的心臟纖維化、自身免疫性疾病引起的腎臟纖維化及特發(fā)性

3、肺間質(zhì)纖維化均有療效。最近，Kharaziha P等利用MSC治療肝硬化Ⅰ-Ⅱ期臨床研究和Salama H等利用MSC治療終末期丙肝肝病研究中發(fā)現(xiàn)MSC在抗肝纖維化方面有一定療效，提示MSC移植在治療肝纖維化方面具有廣闊的應用前景。但由于多個臨床中心的研究結(jié)果并不一致，治療機制尚未明確，均有待于進一步的基礎(chǔ)與臨床研究。
　　目的：研究MSC移植對肝纖維化和HSC活化的影響及其可能機制。
　　方法：Ficoll-Hypaque

4、梯度密度離心法及細胞貼壁培養(yǎng)法分離純化骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cell，BM-MSC)。取18只SD大鼠，通過腹腔小劑量注射CCl48周，進行肝纖維化造模，在造模4周時，取其中9只作為治療組，每周經(jīng)尾靜脈移植給予該組每只大鼠6×106個MSC，持續(xù)4周;另外9只作為模型對照組，經(jīng)尾靜脈移植給予不含MSC的等量生理鹽水，持續(xù)4周;另取9只大鼠，作為正常對照組，僅給予尾靜脈等量生理鹽水注射

5、，持續(xù)4周。自實驗開始，每周用全自動生化分析儀測定血清ALT、AST、TBIL、ALB水平，至結(jié)束共測定8次。實驗終點8周時通過免疫組化方法對α平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin，α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growthfactorβ1，TGF-β1)和Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ，COLⅠ)在肝組織中的定位和表達進行研究;原位灌注和梯度密度離心法分離HSC，326nm紫外光激發(fā)

6、和α-SMA免疫熒光染色法鑒定HSC; qRT-PCR和Western Blot檢測HSC中α-SMA、TGF-β1、COLⅠ、解偶聯(lián)蛋白2(Uncoupling protein2，UCP2)、解偶聯(lián)蛋白3(Uncoupling protein3，UCP3)基因和蛋白的表達水平。
　　結(jié)果：⑴與模型組相比，治療組經(jīng)MSC移植治療后，血清ALT、AST、TBIL水平逐漸呈下降趨勢，經(jīng)統(tǒng)計學分析有顯著差異；⑵治療組肝組織纖維化和炎癥細

7、胞浸潤程度較模型組明顯改善、肝組織α-SMA、TGF-β1和COLⅠ表達水平較模型組明顯減低，經(jīng)統(tǒng)計學分析有顯著差異；⑶與模型組相比，治療組HSC中α-SMA、TGF-β1、COLⅠ基因和蛋白表達水平下降，UCP2、UCP3基因和蛋白的表達水平升高，經(jīng)統(tǒng)計學分析有顯著差異。
　　結(jié)論：①CCl4長期小劑量腹腔注射能誘導典型的肝纖維化模型，造模過程中以BM-MSC尾靜脈注射進行干預治療，可以減輕肝臟炎癥，抑制肝纖維化形成，促進肝功能