生化分析考試要點(diǎn)

1、層析法：層析法：利用混合樣品中，不同物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的分布程度不同而進(jìn)行分離的方法稱其為層析法（或色譜法）。特點(diǎn)：應(yīng)用范圍廣；可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量、定性和純度鑒定；柱層析（columnchromatography）將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品在層析柱中進(jìn)行分離。紙層析（paperchromatography）用濾紙作液體的載體（擔(dān)體suppt），點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開(kāi)，以達(dá)到分離鑒定的目的。薄層層析（thinlayerchromatogra

2、phy）將適當(dāng)粒度的吸附劑在玻璃板上鋪成薄層，以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定分配定律：分配定律：分配系數(shù)K=試樣在固定相中的濃度試樣在移動(dòng)相中的濃度=CASCAM（1）在定溫、定壓下，在一定的溶劑系統(tǒng)中，一定的物質(zhì)其K值保持不變，不同的物質(zhì)其K值不同（2）當(dāng)溫度、壓力或溶劑系統(tǒng)改變時(shí)，對(duì)于一定的物質(zhì)來(lái)說(shuō)，其K值也隨之改變（3）K值大于1，物質(zhì)在S相中的濃度大于其在M相中的濃度，反之則小分配比率（容量因子）k’=化合物在固定相中的

3、量化合物在移動(dòng)相中的量=pqK=（pVs）(qVm)（G=k’）=KVsVm容量因子與溶劑系統(tǒng)的組成、體系的溫度、壓力有關(guān)，還與兩相的體積比值有關(guān)理論塔板數(shù)N及理論塔板高度HETP=L（柱長(zhǎng)）N影響因素HETP=Cmd2uDmCm溶質(zhì)分子的濃度；d固定相顆粒直徑；u流速；Dm溶質(zhì)分子的擴(kuò)散系數(shù)高流速可以高樣品輸出性和高產(chǎn)量；低流速可提高分辨率影響分離的因素：①洗脫曲線的參數(shù)②分離度Rs③分離系數(shù)α（代表了兩個(gè)物質(zhì)在相同的色譜條件下的分離

4、選擇性樣品區(qū)帶擴(kuò)散的因素：柱內(nèi)擴(kuò)散（渦流擴(kuò)散、縱向擴(kuò)散、傳質(zhì)速率）、柱外擴(kuò)散（樣品、層析介質(zhì)、裝柱、層析條件、死體積）塔板理論塔板理論：分配系數(shù)大的組分，每次達(dá)到平衡的時(shí)間長(zhǎng)，從層析柱中后流出。一個(gè)層析柱的塔板數(shù)越多，分離次數(shù)越多，柱效越高理論塔板高度理論塔板高度HETP=Cmd2uDmCm溶質(zhì)分子的濃度溶質(zhì)分子的濃度d固定相顆粒直徑固定相顆粒直徑u流速流速Dm溶質(zhì)分子的擴(kuò)散系數(shù)溶質(zhì)分子的擴(kuò)散系數(shù)聚焦層析聚焦層析（chromatofoc

5、using）它是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的差異與蛋白質(zhì)的離子交換作用進(jìn)行分離純化的。適用于分離某些蛋白質(zhì)分子量和極性方面的性質(zhì)十分接近，而等電點(diǎn)有區(qū)別的物質(zhì)特點(diǎn)：特點(diǎn)：①離容量大（能分離幾百毫克蛋白質(zhì)樣品）②辨率很高（有洗脫峰被聚焦效應(yīng)濃縮，峰寬度可達(dá)0.040.05pH單位）；③作簡(jiǎn)單（不需特殊的操作裝置）從分離的蛋白質(zhì)中去除多緩沖劑的方法：沉淀法。凝膠過(guò)濾法、親和層析法、疏水層析法。親和層析親和層析AC（AffinityChromatog

6、raphy）：根據(jù)生物分子間親和吸附和解吸的原理建立起來(lái)①?gòu)?qiáng)酸型：SM磺甲基；SE磺乙基強(qiáng)酸性，用于極低pH；SP磺丙基；P磷酸低pH②弱酸型：CM羧甲基pH4以上陰離子交換劑（堿性）：陰離子交換劑中的可解離基團(tuán)是：伯胺:NH3；仲胺:NH2CH3叔胺:NH(CH3)2；季胺:N(CH3)3（弱→強(qiáng)）①?gòu)?qiáng)堿型：Q三甲基氨基甲基；TEAE三乙基氨基乙基3QAE二乙基(α羥丙基)氨基乙基②弱堿型：DEAE二乙基氨基乙基pH8.6以下支持物：

7、樹(shù)脂；纖維素；凝膠（葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠）離子交換劑的理化性質(zhì)離子交換劑的理化性質(zhì)：酸堿性，交換容量，顆粒直徑，網(wǎng)孔大小，使用的pH范圍，使用的溫度范圍，耐受的溶劑系統(tǒng)，顏色，耐壓程度，氣味，比重，吸水膨脹率。離子交換平衡的選擇性系數(shù)離子交換平衡的選擇性系數(shù)：K磺酸型離子交換樹(shù)脂對(duì)陽(yáng)離子的親和規(guī)律：在稀的水溶液中，同價(jià)離子：原子序數(shù)↑，離子半徑↑水化半徑↓，親和力↑；不同價(jià)離子：價(jià)數(shù)↑，親和力↑。LiSO22C2O42INO2CrO4

8、2BrscnClHCOOOHFCH3COO離子交換動(dòng)力學(xué)：膜擴(kuò)散離子交換動(dòng)力學(xué)：膜擴(kuò)散→粒子擴(kuò)散粒子擴(kuò)散→交換反應(yīng)交換反應(yīng)→粒子擴(kuò)散粒子擴(kuò)散→膜擴(kuò)散膜擴(kuò)散吸附狀態(tài)吸附狀態(tài)：牢固吸附、有限吸附平衡、完全解吸。轉(zhuǎn)變條件轉(zhuǎn)變條件：pH，離子強(qiáng)度離子交換柱層析的洗脫方式洗脫方式：①恒溶劑洗脫：采用固定pH及離子強(qiáng)度的洗脫方法；②梯度洗脫：采用連續(xù)改變pH、離子強(qiáng)度的洗脫方法（梯度類型包括pH、離子強(qiáng)度、pH與離子強(qiáng)度）③階段洗脫：采用相繼改變p

9、H、離子強(qiáng)度的洗脫方法陰離子pH從高到低e.g.陽(yáng)離子B吸附在柱上，洗脫可采用不同的緩沖液，開(kāi)始時(shí)采用氫離子濃度較低的緩沖液，然后在該緩沖液中逐漸增加氫離子濃度以取代吸附在柱上的B離子；或在同一種pH值的緩沖液中增加離子強(qiáng)度；或在相同pH值和離子強(qiáng)度的緩沖液中加入一種比離子交換層析介質(zhì)親和力更強(qiáng)的陽(yáng)離子來(lái)取代吸附在柱上的B離子。對(duì)于具有兼性離子的生物大分子，要對(duì)溶液的pH值，生物大分子的等電點(diǎn)和離子交換層析介質(zhì)三種情況同時(shí)進(jìn)行考慮。介質(zhì)

10、選擇：緩沖液的pH值高于樣品等電點(diǎn)，選擇陰離子交換介質(zhì)，蛋白質(zhì)向陽(yáng)極跑反向?qū)游龇聪驅(qū)游鯮PC：是利用被分離樣品中不同生物分子表面的極性差別，而將其分離純化的一種層析技術(shù)。反相層析的固定相是非極性的，流動(dòng)相繼續(xù)大，非極性樣品親和力大用有機(jī)溶劑，極性小，則非極性樣品親和力小，先出來(lái)特點(diǎn)特點(diǎn)：高效，一般用于分離小分子極性大的物質(zhì)金屬螯合層析金屬螯合層析MCC或IMAC金屬螯合層析是利用不同蛋白質(zhì)分子表面所含組氨酸的差別而將其分離純化的一種層析