免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)原理及方法

1、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)原理及方法免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)原理及方法免疫共沉淀（免疫共沉淀（CoIP）概述及原理）概述及原理免疫共沉淀（CoImmunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白蛋白間相互作用的經(jīng)典方法，屬于免疫沉淀技術(shù)的一類，常被用于鑒定特定蛋白復(fù)合物的中未知蛋白組分。免疫共沉淀的設(shè)計(jì)理念是，假設(shè)一種已知蛋白是某個(gè)大的蛋白復(fù)合物的組成成員，那么利用這種蛋白的特異性抗體，就可能將整個(gè)蛋白復(fù)合物從溶液中“拉”下來（常說的“pulldow

2、n”），進(jìn)而可以用于鑒定這個(gè)蛋白復(fù)合物中的其他未知成員。免疫共沉淀的特點(diǎn)可以概括為兩點(diǎn)，免疫共沉淀的特點(diǎn)可以概括為兩點(diǎn)，第一是天然狀態(tài)，第二是蛋白復(fù)合物。第一是天然狀態(tài)，第二是蛋白復(fù)合物。免疫共沉淀的優(yōu)勢：免疫共沉淀的優(yōu)勢：與其他研究蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)（如GSTPulldown、酵母雙雜交等）相比，免疫共沉淀鑒定的相互作用蛋白是在細(xì)胞內(nèi)與目的蛋白發(fā)生的天然結(jié)合，避免了人為的影響，因此符合體內(nèi)實(shí)際情況，得到的蛋白可信度更高。免疫共沉淀的局

3、限性和注意事項(xiàng)：免疫共沉淀的局限性和注意事項(xiàng)：1.免疫共沉淀是建立在蛋白復(fù)合物成員間彼此緊密結(jié)合的基礎(chǔ)上，意味著松散結(jié)合的蛋白組分很可能檢測不到；2.由于蛋白質(zhì)形成復(fù)合物以后，某些表位就會(huì)被掩蓋，因此可能導(dǎo)致使用某一種pulldown抗體，無論怎么增加抗體濃度，也極少能將不到一半的目標(biāo)蛋白復(fù)合物沉淀出來，如有必要最好使用多種不同抗體分別進(jìn)行CoIP；1.用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次；Carefullywashculturedcellswi

4、thprechilledPBSf2times.2.加入預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液（107細(xì)胞加入1ml）；AddincoldRIPAlysisbuffer(1mlf107cells).3.用預(yù)冷的細(xì)胞刮將細(xì)胞從培養(yǎng)介質(zhì)上刮離，并轉(zhuǎn)移到干凈的1.5EP管中。并置于低速搖床，4℃緩慢晃動(dòng)15min；Scrapcellsofftoclean1.5mleppendftubeswithacleancoldscraper.Putthemonalows

5、peedrotatingshakerf15minat4C.4.4℃，14000g離心15min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中Centrifugeat14000g4Cf15mintransferthesupernatanttonewtubesimmediately.5.將ProteinAGagarose微球用PBS洗兩遍，用PBS配制成50%的proteinAGagarose工作液；WashproteinAGagarosebeadsf