水稻OsVPE3轉(zhuǎn)基因株系的構(gòu)建及原生質(zhì)體免疫共沉淀體系的探究.pdf

1、細(xì)胞程序性死亡（Programmed cell death, PCD）是一類由生物體控制的有序的死亡現(xiàn)象，對生物體正常的生長發(fā)育及其抵抗各類生物和（或）非生物性脅迫具有重要意義[1]。在植物中，已分析鑒定出了一系列和動物細(xì)胞PCD調(diào)控蛋白具有相似結(jié)構(gòu)、功能的蛋白質(zhì)，但對某些關(guān)鍵蛋白酶如caspase知之甚少，尚未建立起比較完整的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通路[2-5]。
　　液泡加工酶(Vacuolar processing enzyme，VP

2、E)是一類半胖氨酸蛋白酶，屬于蛋白酶C13家族。液泡加工酶在種子儲存蛋白加工成熟、種皮形成、細(xì)胞程序性死亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明在非生物脅迫中，抗凋亡基因Bcl-2可以顯著抑制水稻OsVPE2和OsVPE3基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，從而抑制PCD的發(fā)生和提高水稻的脅迫耐受性。因此，我們期望通過構(gòu)建OsVPE3的水稻轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)一步研究OsVPE在非生物脅迫中的作用。
　　蛋白質(zhì)之間的相互作用，對于維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和

3、發(fā)揮生物功能具有重要意義。本研究在水稻原生質(zhì)體瞬時表達(dá)系統(tǒng)中，利用免疫共沉淀和Pull-down技術(shù)，探索了抗凋亡基因Bcl-2潛在的互作蛋白。
　　目前取得了如下成果:
　　1.OsVPE3表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因水稻的獲得
　　構(gòu)建了OsVPE3（Os02g0644000）基因相應(yīng)的啟動子、干涉、過表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌侵染介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織，潮霉素篩選得到了抗性幼苗。
　　2.OsVPE3各株系篩選和

4、表達(dá)量分析
　　對抗性幼苗進(jìn)行潮霉素篩選、繁育，篩選得到VPE3兩個T3代過表達(dá)純系（命名為M3-7-1和M3-8-7）和一個T3代干涉純系（命名為M7-9-1）。
　　對上述株系進(jìn)行了實(shí)時定量PCR鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型相比，OsVPE3過表達(dá)株系M3-7-1和M3-8-7中，OsVPE3 mRNA水平分別上升到1006倍和577倍;而在干涉株系M7-9-1中，其表達(dá)水平下調(diào)到0.24倍。
　　OsVPE3基因

5、的啟動子分析轉(zhuǎn)基因材料目前處于T1代，在DNA水平上鑒定出了5個獨(dú)立陽性株系。
　　3.OsVPE3蛋白的亞細(xì)胞定位分析
　　構(gòu)建了OsVPE3-GFP融合蛋白的pUGW5-VPE3瞬時表達(dá)載體，進(jìn)行水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，并利用共聚焦熒光顯微鏡觀察OsVPE3-GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，OsVPE3融合蛋白的綠色熒光分布于液泡中，同時在細(xì)胞其他部分（如胞質(zhì)）也存在著熒光信號。這揭示了OsVPE3蛋白最終定位于中央液泡

6、，其他細(xì)胞部分存在熒光信號可能是由于OsVPE3融合蛋白仍處于修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)過程。
　　4.水稻中Bcl-2相互作用蛋白的探究
　　構(gòu)建了若干植物瞬時表達(dá)載體如pUGW11-Bcl2（實(shí)驗(yàn)組載體）和pUGW11-GFP（對照組載體），并優(yōu)化了原生質(zhì)體制備培養(yǎng)條件，成功在原生質(zhì)體中積累表達(dá)相應(yīng)的融合蛋白。
　　結(jié)合免疫共沉淀和Pull-down技術(shù)，利用anti-FLAG beads成功分離純化了Bcl2-FLAG和GFP-