水稻OsVPE3轉基因株系的構建及原生質體免疫共沉淀體系的探究.pdf

1、細胞程序性死亡（Programmed cell death, PCD）是一類由生物體控制的有序的死亡現(xiàn)象，對生物體正常的生長發(fā)育及其抵抗各類生物和（或）非生物性脅迫具有重要意義[1]。在植物中，已分析鑒定出了一系列和動物細胞PCD調控蛋白具有相似結構、功能的蛋白質，但對某些關鍵蛋白酶如caspase知之甚少，尚未建立起比較完整的基因調控網(wǎng)絡通路[2-5]。
　　液泡加工酶(Vacuolar processing enzyme，VP

2、E)是一類半胖氨酸蛋白酶，屬于蛋白酶C13家族。液泡加工酶在種子儲存蛋白加工成熟、種皮形成、細胞程序性死亡過程中發(fā)揮著關鍵作用。本實驗室前期研究表明在非生物脅迫中，抗凋亡基因Bcl-2可以顯著抑制水稻OsVPE2和OsVPE3基因的轉錄水平上調，從而抑制PCD的發(fā)生和提高水稻的脅迫耐受性。因此，我們期望通過構建OsVPE3的水稻轉基因株系，進一步研究OsVPE在非生物脅迫中的作用。
　　蛋白質之間的相互作用，對于維持蛋白質的結構和

3、發(fā)揮生物功能具有重要意義。本研究在水稻原生質體瞬時表達系統(tǒng)中，利用免疫共沉淀和Pull-down技術，探索了抗凋亡基因Bcl-2潛在的互作蛋白。
　　目前取得了如下成果:
　　1.OsVPE3表達載體的構建和轉基因水稻的獲得
　　構建了OsVPE3（Os02g0644000）基因相應的啟動子、干涉、過表達載體，利用農桿菌侵染介導法轉化成熟胚誘導愈傷組織，潮霉素篩選得到了抗性幼苗。
　　2.OsVPE3各株系篩選和

4、表達量分析
　　對抗性幼苗進行潮霉素篩選、繁育，篩選得到VPE3兩個T3代過表達純系（命名為M3-7-1和M3-8-7）和一個T3代干涉純系（命名為M7-9-1）。
　　對上述株系進行了實時定量PCR鑒定。實驗結果顯示，與野生型相比，OsVPE3過表達株系M3-7-1和M3-8-7中，OsVPE3 mRNA水平分別上升到1006倍和577倍;而在干涉株系M7-9-1中，其表達水平下調到0.24倍。
　　OsVPE3基因

5、的啟動子分析轉基因材料目前處于T1代，在DNA水平上鑒定出了5個獨立陽性株系。
　　3.OsVPE3蛋白的亞細胞定位分析
　　構建了OsVPE3-GFP融合蛋白的pUGW5-VPE3瞬時表達載體，進行水稻原生質體轉化，并利用共聚焦熒光顯微鏡觀察OsVPE3-GFP融合蛋白的亞細胞定位。結果表明，OsVPE3融合蛋白的綠色熒光分布于液泡中，同時在細胞其他部分（如胞質）也存在著熒光信號。這揭示了OsVPE3蛋白最終定位于中央液泡

6、，其他細胞部分存在熒光信號可能是由于OsVPE3融合蛋白仍處于修飾、轉運過程。
　　4.水稻中Bcl-2相互作用蛋白的探究
　　構建了若干植物瞬時表達載體如pUGW11-Bcl2（實驗組載體）和pUGW11-GFP（對照組載體），并優(yōu)化了原生質體制備培養(yǎng)條件，成功在原生質體中積累表達相應的融合蛋白。
　　結合免疫共沉淀和Pull-down技術，利用anti-FLAG beads成功分離純化了Bcl2-FLAG和GFP-