免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜篩選肝核因子HNF3β相互作用蛋白質(zhì)及初步功能研究.pdf

1、肝細胞核因子HNF3β是一類在肝臟中富集表達的轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控多種肝臟基因的組織特異性表達,參與維持肝臟正常的表型與生理功能。敲除HNF3β的小鼠不能形成正常的神經(jīng)脊索并早期胚胎致死, HNF3β的變異可能與2型糖尿病的發(fā)生相關(guān)。HNF3β參與糖代謝、脂肪代謝、調(diào)控膽酸以及生長相關(guān)基因的表達調(diào)控。HNF3β在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的過程中需要募集多種輔助因子協(xié)同發(fā)揮作用。對HNF3β相互作用蛋白質(zhì)的挖掘研究,有助于更深入的探索HNF3β在生命過程中

2、的功能及作用機制。目前有關(guān)HNF3β蛋白質(zhì)間相互作用的報道還相對較少,已知的與HNF3β發(fā)揮相互作用的蛋白質(zhì)只有8個,包括OTX2,SRC1,TLE1,HOXA5,HNF6A,GSC,EN2,LHX1等,它們都參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。這些數(shù)據(jù)對于全面的闡明HNF3β蛋白復合體的組成及動態(tài)變化還是遠遠不夠的。目前大規(guī)模研究蛋白質(zhì)間相互作用的方法主要有酵母雙雜交技術(shù),但由于要去除轉(zhuǎn)錄激活區(qū),因此并不適用于研究轉(zhuǎn)錄因子。免疫共沉淀技術(shù)可用于研究生理水平

3、下蛋白質(zhì)間的相互作用,隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,其準確性高與速度快的優(yōu)點使免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于尋找生理水平下新的相互作用。
　　本研究對HNF3β相互作用蛋白質(zhì)進行了分離鑒定,并對LMNA-HNF3β相互作用介導的生物學功能進行了初步的研究。以HNF3β特異抗體免疫沉淀分離HepG2細胞內(nèi)HNF3β蛋白質(zhì)復合體,SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍染色,切取與對照組存在差異的條帶進行SDS-PAGE膠上蛋白質(zhì)LTQ質(zhì)譜鑒

4、定其組成成分。本文通過4次獨立重復實驗共獲得53個相互作用數(shù)據(jù),生物信息學分析發(fā)現(xiàn),其中與HNF3β共定位的蛋白質(zhì)有9個,具有相互作用結(jié)構(gòu)域的的蛋白質(zhì)有5個,有10個分子同靶蛋白具有相同GO注釋,有9個分子與靶蛋白之間存在間接相互作用。基于這些分析結(jié)果,挑選其中4個相互作用分子,構(gòu)建真核表達載體,進行報告基因?qū)嶒灪屯庠葱悦庖吖渤恋韺嶒灥尿炞C。驗證了LMNA與HNF3β的相互作用,報道基因?qū)嶒灡砻鱈MNA可以影響 HNF3β的轉(zhuǎn)錄活性。免