免疫共沉淀蛋白芯片分析方法及其應(yīng)用的研究.pdf

1、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是一種以抗體和抗原之間的特異性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的常規(guī)方法，可用來確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的存在與否。針對(duì)免疫共沉淀檢測(cè)方法相對(duì)繁瑣、操作誤差大、結(jié)果不易數(shù)字化等弱點(diǎn)，本文第一部分建立了一種基于芯片的免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用的分析方法，該方法結(jié)合傳統(tǒng)的免疫共沉淀和蛋白質(zhì)陣列芯片技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，快速檢測(cè)蛋白-蛋白之間的相互作用。此方法將nl級(jí)

2、的anti-Flag M2抗體固定在醛基修飾的芯片表而，利用重組蛋白的表位標(biāo)簽將帶有Flag誘餌蛋白和Myc獵物蛋白的細(xì)胞裂解液在芯片上進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，通過熒光標(biāo)記的anti-Myc抗體檢測(cè)免疫共沉淀的蛋白，采用熒光芯片掃描儀可獲得蛋白-蛋白相互作用的信號(hào)。
　　 本文第二部分介紹一種可視化免疫共沉淀芯片檢測(cè)技術(shù)。在免疫共沉淀芯片技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合銀染色放大和免疫膠體金技術(shù)實(shí)現(xiàn)了可視化檢測(cè)。該方法無需借助昂貴的檢測(cè)儀器即可觀察到

3、相互作用信號(hào)。通過生物素與鏈親和素的強(qiáng)結(jié)合能力使樣品標(biāo)記上膠體金，最后使用銀增強(qiáng)顯色液顯色，一旦銀增強(qiáng)試劑加入，樣品點(diǎn)上的膠體金則作為一個(gè)催化試劑催化銀離子的還原反應(yīng)發(fā)生。被還原出來的銀以膠體金為沉積位點(diǎn)不斷的積聚直到出現(xiàn)肉眼明顯可見的黑色信號(hào)。可視化免疫共沉淀芯片檢測(cè)技術(shù)為我們提供了一個(gè)檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用的有效平臺(tái)，該技術(shù)快速、靈敏、可實(shí)現(xiàn)高通量的檢測(cè)。使用銀增強(qiáng)顯色技術(shù)使結(jié)果可視化，避免了使用價(jià)格昂貴的熒光掃描儀。
　　

4、 本文第三部分我們成功地將酪胺信號(hào)放大系統(tǒng)和銀增強(qiáng)方法相結(jié)合，開發(fā)出一種蛋白芯片的高靈敏度的顯色檢測(cè)方法。利用目標(biāo)分子團(tuán)上的HRP酵素將帶有被生物素標(biāo)記過的Tyramide催化后形成自由基，此自由基會(huì)與目標(biāo)分子附近的Tyrosine結(jié)合，導(dǎo)致每一個(gè)目標(biāo)分子團(tuán)上有多個(gè)被標(biāo)記過的Tyramide，從而達(dá)到信號(hào)放大的效果。研究實(shí)驗(yàn)通過雙抗夾心的模式，對(duì)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，其中包括固定抗體的濃度，檢測(cè)抗體的濃度，鏈親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶