sars病原與檢測

1、SARS病原與檢測,中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所闞 飆,SARS病原與檢測,中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所闞 飆,引起肺炎的病原體,細菌 肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、甲型溶血性鏈球菌、肺炎克雷白桿菌、 流感嗜血桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、腸桿菌屬一些細菌、變形桿 菌、軍團菌、棒狀桿菌、梭狀桿菌等病毒

2、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、巨細胞 病毒、單純皰疹病毒、漢坦病毒、禽流感病毒、尼巴病毒、冠狀病毒等支原體 肺炎支原體衣原體 肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體真菌 白色念珠菌、曲菌、放線菌等其它 立克次體（Q熱立克次體等）、弓形蟲（鼠弓形蟲等)、原蟲（卡氏肺孢 子蟲

3、等）、寄生蟲類（肺包蟲、肺吸蟲、肺血吸蟲等）,冠狀病毒,冠狀病毒科（Coronaviridae）單鏈RNA，包括冠狀病毒屬和環(huán)曲病毒屬1937年從小雞體內(nèi)分離到傳染性支氣管炎病毒（IBV)1951年，鼠肝炎病毒（MHV)1965年，從人上呼吸道感染患者分離到B814病毒1966年，分離到229E病毒（人冠狀病毒HCoV-229E）1968年，電鏡觀察病毒形態(tài)，命名冠狀病毒1975年，ICTV命名冠狀病毒科,冠狀病毒屬血清

4、分學分組及所致疾病血清分組 病毒種和株 宿主 呼吸道疾病 腸道疾病 肝炎 神經(jīng)系統(tǒng)感染 其它 HCoV -229E （人冠狀病毒229E株） 人 ＋

5、 ？ TGEV（豬傳染性胃腸炎病毒） 豬 ＋ ＋ ＋ I CCoV（犬冠狀病毒） 狗

6、 ＋ FECoV（貓冠狀病毒） 貓 ＋ FIPV （貓傳染性腹膜炎病毒） 貓 ＋ ＋

7、 ＋ ＋ RbCoV（兔冠狀病毒） 兔 ＋ ＋ HCoV-OC43 （人冠狀病毒OC43株）

8、 人 ＋ ？ ？ MHV（鼠肝炎病毒） 小鼠 ＋ ＋ ＋ ＋ II BCoV

9、（牛冠狀病毒） 牛 ＋ ＋ TCoV（火雞冠狀病毒） 火雞 ＋ ＋ HEV

10、 豬 ＋ ＋ ＋ III TCoV （火雞冠狀病毒） 火雞 ＋ ＋ IBV

11、 雞 ＋ ＋ SARS-CoV,,,,,,,引自 賀福初主編. 嚴重急性呼吸綜合征.科學出版社，2019.,SARS病原體的發(fā)現(xiàn)與確證,2019年11月，廣東出現(xiàn)SARS病人2019年3月15日，WHO組織國際研究網(wǎng)絡實驗室

12、3月18日－20日，觀察到副粘病毒顆粒以及獲得相關序列3月21日，猴腎細胞培養(yǎng)獲得病毒分離物，并排除甲乙型流感病毒病毒、、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1、2、3型、腺病毒、鼻病毒、腸道病毒、人間質(zhì)肺炎病毒等，報告發(fā)現(xiàn)衣原體顆粒3月22日，發(fā)現(xiàn)冠狀病毒樣顆粒3月23日，明確發(fā)現(xiàn)冠狀病毒顆粒和核酸片段，開始靈長類動物實驗3月24－4月11日，獲得更多的SARS病毒分離物、核酸片段序列，抗體檢測4月12日、14日，SARS冠狀病毒的

13、全基因組序列公布4月16日，WHO宣布確認一種變異冠狀病毒引起SARS4月17日，利用動物實驗按科赫原則確定SARS病原體－SARS coronavirus,“SARS的研究速度令人驚訝。由于全世界各國實驗室之間非同尋常的合作，我們現(xiàn)在肯定地知道誰是SARS的元兇。” （WHO傳染病規(guī)劃執(zhí)行主任David Heymann 博士）,,2019,348:1953-1966,SARS CoV基因組,2019,348:1967-1976.,

14、冠狀病毒顆粒結(jié)構(gòu),From N Engl J Med, 2019,348:1948-1951.,2019,348:1953-1966,SARS病毒變異變異的意義？變異的方向？追蹤變異的意義病原基本特征結(jié)合流行病學分析尋找傳播鏈預測新的流行？疫苗設計,,,標本采集、保存與運輸種類 最佳采集時間 采樣

15、 用途咽拭子與 發(fā)熱早期 消毒的帶塑料桿滌綸織物或人造纖維拭子簽 鼻咽拭子 含2ml病毒保存液（或等滲鹽溶液、組織 病毒分離、PCR

16、 培養(yǎng)液等）的旋 蓋塑料凍存管，冷藏運輸 鼻咽清洗物 發(fā)熱早期 導管，無菌生理鹽水 病毒分離、PCR漱口液 發(fā)熱早期 5-10ml無菌鹽水，置無菌旋 蓋塑料離心管 病毒分離、PCR痰液

17、 無時間限制 無菌平皿，拭子簽刮取至含5ml運輸液的 病毒分離、PCR 旋 蓋塑料離心管下呼吸道標本 無時間限制 支氣管灌洗、氣管吸取液置旋 蓋塑料離心管 病毒分離、PCR糞便

18、 一周后檢出率高 5-10g，旋 蓋塑料離心管 病毒分離、PCR尿液 一周后檢出率高 10-20ml 旋 蓋塑料離心管 病毒分離、PCR血液 急性期和恢

19、復期 抗凝管和析出血清用的血液采集管 急性期全血可作病毒 分離、PCR，血清作

20、 抗體檢測尸檢標本 采集肺、氣管、腎、脾、肝、心臟、腦、

21、 病毒分離、PCR、 淋巴結(jié)等，樣品運輸液為Hank氏液、Eagle液 電鏡觀察 等（加青、鏈霉素和制霉菌素），立即凍存；

22、 福爾馬林固定者室溫保存,,,,標本運輸與儲存臨床采集的標本，宜盡快送至專業(yè)檢測實驗室，在運送抵達前的24-48小時內(nèi)，標本可4?C冷藏（非福爾馬林固定的尸檢標本冷凍保存）。檢測實驗室內(nèi)長期保存，血液標本-20 ?C冷凍保存，其它-70 ?C保存。,標本的生物安全操作采集與運輸 標本管：螺旋蓋、密封，貼生物危險性提示標簽 運輸過程中保證密封

23、處理任何可能產(chǎn)生氣溶膠的操作均應在生物安全柜內(nèi)進行。操作者個人防護。? 二級生物安全（BSL-2）裝備內(nèi)進行的操作： 血清和血標本的各種常規(guī)診斷性檢查。? 三級生物安全（BSL-2）室內(nèi)進行的操作： SARS病原體分離培養(yǎng)、濃縮 標本中核酸提取 動物接種醫(yī)務人員對SARS或疑似病人采樣時的個人防護 口罩（符合N,R,P95/99/1

24、00, FFP2/3標準）、護目鏡、手套、隔離衣在沒有把握控制病毒泄漏（包括產(chǎn)生氣溶膠）的情況下，不能進行標本的操作,SARS檢測及結(jié)果解釋檢測方法抗體（IgG/IgM)： － ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay) 酶聯(lián)免疫吸附實驗 － IFA (Indirect ImmunoFluorescence Assay ) 間接免疫熒光實驗

25、核酸（RNA）： － RT-PCR（Reversed transcription - Ploymerase Chain Reaction） ? Nested PCR ? real - time PCR － gene chip病毒分離

26、 － 細胞培養(yǎng),SARS檢測及結(jié)果解釋解釋（Interpretation of test results）陽性結(jié)果- 對于PCR和細胞培養(yǎng)：SARS病人正在或近期被SARS病毒感染。- 對于ELISA和IFA ：正在或近期被SARS病毒感染，或既往感染（需注意不同檢測方法的特異性）陰性結(jié)果 - 病人沒有被SARS病毒感染，而是由其它傳染性（病毒、細菌、真菌）或非傳染性因素。 - 實驗結(jié)果不

27、正確（“假陰性”）。目前的方法需要提高靈敏度。 - 對于PCR和細胞培養(yǎng)：病人標本并沒有在病毒或其遺傳物質(zhì)出現(xiàn)的時段內(nèi)采集。病毒及其遺傳物質(zhì)僅存在一段較短的時期（依賴于不同標本種類）。 - 對于ELISA和IFA：標本收集過早，抗體還沒有產(chǎn)生。(檢測SARS病毒結(jié)果為陰性并不就表示病人沒有感染SARS病毒),Laboratory case definition of SARS A person wit

28、h symptoms and signs that are clinically suggestive of SARS AND with positive laboratory findings for SARS-CoV based on one or more of the following diagnostic criteria:a) PCR positive for SARS-CoV PCR positive using a

29、 validated method from: At least two different clinical specimens (eg nasopharyngeal and stool) OR The same clinical specimen collected on two or more occasions during the course of the illness (eg sequential nasophary

30、ngeal aspirates) OR Two different assays or repeat PCR using a new RNA extract from the original clinical sample on each occasion of testing. b) Seroconversion by ELISA or IFA Negative antibody test on acute serum fol

31、lowed by positive antibody test on convalescent phase serum tested in parallel OR Fourfold or greater rise in antibody titre between acute and convalescent phase sera tested in parallel. c) Virus isolationIsolation in

32、 cell culture of SARS-CoV from any specimen AND PCR confirmation using a validated method. Testing should only be undertaken in a national or regional reference laboratory as per WHO recommendations (Use of laboratory m

33、ethods for SARS diagnosis ). WHO will assist resource poor countries to confirm their first cases of SARS through laboratory collaboration.Alert, verification and public health management of SARS in the post-outbreak pe

34、riod -WHO,Recommendations on interpretation of laboratory results Positive SARS diagnostic test findings a) Confirmed positive PCR for SARS virus: -at least 2 different clinical specimens (eg nasopharyngeal and stool)

35、 OR - the same clinical specimen collected on 2 or more days during the course of the illness (eg 2 or more nasopharyngeal aspirates) OR-2 different assays or repeat PCR using the original clinical sample on

36、 each occasion of testing b) Seroconversion by ELISA or IFA:-negative antibody test on acute serum followed by positive antibody test on convalescent serum OR- four-fold or greater rise in antibody titre between acu

37、te and convalescent phase sera tested in parallel c) Virus isolation:-Isolation in cell culture of SARS-CoV from any specimen; plus PCR confirmation using a validated method. Confirmation of positive PCR -The PCR pro

38、cedure should include appropriate negative and positive controls in each run, which should yield the expected results: 1 negative control for the extraction procedure and 1 water control for the PCR run 1 positive cont

39、rol for extraction and PCR run the patient sample spiked with a weak positive control to detect PCR inhibitory substances (inhibition control) -If a positive PCR result has been obtained, it should be confirmed by:rep

40、eating the PCR using the original sample ORhaving the same sample tested in a second laboratory. Amplifying a second genome region could further increase test specificityUse of laboratory methods for SARS diagnosis

41、-WHORecommendations on interpretation of laboratory results Recommendations for laboratories testing for SARS,,Recommendations for laboratories testing for SARS Reference laboratories should be identified at nationa

42、l level.PCR testing Laboratories testing for SARS by PCR should already have experience with PCR testing. They should adopt quality control procedures and identify a partner laboratory in their country or among the WHO

43、 collaborating research laboratories listed in Multi-centre Collaborative Network: Laboratories testing for SARS to cross-check their positive findings.Laboratories performing SARS specific PCR tests should adopt strict

44、 criteria for confirmation of positive results , especially in low prevalence areas, where the positive predictive value might be lower.A PCR-kit for SARS is commercially available, including internal controls. PCR prim

45、ers and procedures have been published and can be adapted by laboratories. Positive control RNA is available from the Bernhard-Nocht Institute in Hamburg, Germany.The sensitivity of PCR tests for SARS depends on the spe

46、cimen and the time of testing during the course of the illness. This may result in real cases of SARS testing negative by PCR (false negative results). Sensitivity can be increased if multiple specimens/ multiple body si

47、tes are tested.The specificity of PCR tests for SARS is excellent if technical procedures used follow quality control guidelines. False positive results may arise as a result of technical problems (e.g. laboratory conta

48、mination), so every positive PCR test should be verified.Antibody testing ELISA and IFA tests are being developed by research laboratories.Because SARS a new disease in humans, SARS-CoV antibodies are not found in po