SARS-CoV非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)、純化及其在SARS病人血清抗體水平檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、SARS冠狀病毒(SARS-CoV)是嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(SARS)發(fā)生的病因，它是一種與現(xiàn)已知的其他冠狀病毒不同的新型冠狀病毒。除含有己知的四個(gè)結(jié)構(gòu)基因外，SARS-CoV還有能編碼3a、3b、7a等功能未知基因的ORF，認(rèn)為它們編碼一些非結(jié)構(gòu)蛋白。為探索在SARS病人體內(nèi)是否存在這些非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體和為以后研究3a、3b、7a蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能提供線(xiàn)索和工具。本實(shí)驗(yàn)首先克隆SARS-CoV(BJ01)的3a、3b、7a基因和結(jié)構(gòu)

2、基因N，構(gòu)建pET28a-N、pGEX6P-1-3a、pGEX6P-1-3b、pGEX6P-1-3a(157-274aa)、pGEX6P-1-3b(81-154aa)原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)，經(jīng)Westernblot鑒定后，融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE或親和層析純化后包被96孔板，對(duì)10個(gè)SARS病人和正常人血清內(nèi)抗體水平進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示，在病人體內(nèi)有很高水平的N蛋白抗體，病人血清對(duì)的帶GST標(biāo)簽的3a

3、、3b融合蛋白也有反應(yīng)，但是，病人血清對(duì)包被的載體蛋白GST也略有反應(yīng)。為排除融合蛋白中載體蛋白對(duì)ELISA結(jié)果的影響，重新構(gòu)建pET32a-3a(157-274aa)、pET32a-3b(81-154aa)、pET32a-7a(17-101aa)表達(dá)載體，進(jìn)行表達(dá)，并利用thrombin切除融合蛋白中的載體蛋白，SDS-PAGE純化后再次進(jìn)行ELISA檢測(cè)，以450nm處病人血清對(duì)蛋白的反應(yīng)值與正常人血清對(duì)蛋白的反應(yīng)值的比值大于2.1

4、作為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果：在21份臨床確診SARS病人的血清樣本中，有20個(gè)樣本對(duì)N蛋白有強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，檢出率為95.2％。對(duì)3a有16個(gè)樣本有較強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，檢出率為76.2％。對(duì)7a有12個(gè)樣本有陽(yáng)性反應(yīng)，檢出率為57.1％。對(duì)3b蛋白則只有7例顯示是陽(yáng)性，結(jié)果提示：在SARS病人血清中存在SARS-N、3a的抗體，可能有7a蛋白和3b蛋白的抗體，推測(cè)在病毒感染病人體內(nèi)有非結(jié)構(gòu)蛋白3a的表達(dá)。在另外10個(gè)病人血清對(duì)3a、3b、7a和N蛋白