膿汁與糞便標本中病原菌的檢測-4

1、斜面培養(yǎng)物4支，營養(yǎng)肉湯4支，生理鹽水2支，鏡油瓶、拭鏡紙1套，吸水紙1本，載玻片4張。,器材準備,染色瓶6組，染色架8個。,醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實驗綜合性實驗一,膿汁和糞便標本中病原菌的檢測（四）斜面培養(yǎng)物的觀察革蘭染色法肉湯接種法顯微鏡油鏡的使用,斜面培養(yǎng)物的觀察,從普通平板上挑取的金黃色或白色菌落接種的斜面，菌苔的顏色，還是原來菌落的顏色，金黃色或白色。從伊紅美藍平板上挑取的紫黑色或粉紅色菌落接種的斜面，菌苔已經(jīng)沒有原來菌落

2、的顏色。菌苔灰白色、表面濕潤、光滑、不透明或半透明。為了講解方便，以后的實驗，仍然沿用初次分離得到菌落的顏色—紫黑或粉紅。從斜面上取菌時，一般只取半個小菌落大小的菌量；接種環(huán)或接種針在菌苔上輕刮一下即可。,,Isolation and identification of bacteria from clinical specimens (Pus & Stool) -- workflow,① culture media pre

3、paration,② isolated culture of bacteria,③ pure culture of bacteria,④ morphological examination of bacteria,⑤ biochemisty, mobility, SCT & AST of bacteria,⑥ serologic test, results analysis → paper writing,,,,,,細菌染色法,

4、單染色法：只用一種染料染色，能清楚觀察菌體大小、形態(tài)與排列，不能鑒別細菌。復(fù)染色法（鑒別染色）：采用兩種以上的不同染料進行先后染色，可將細菌染成不同的顏色，以便鑒別細菌?？顾崛旧?用于檢查結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌等抗酸性細菌(※一些一旦用某些方法染色后，能夠抵抗酸性酒精脫色的細菌)，陽性者為紅色。特殊染色：莢膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，極體染色（用于白喉桿菌異染顆粒染色）。,結(jié)核分枝桿菌抗酸染色,麻風(fēng)分枝桿菌抗酸染色,產(chǎn)氣莢

5、膜梭菌莢膜Hiss 染色,破傷風(fēng)梭菌芽胞芽胞染色,變形桿菌鞭毛Leifson染色,白喉棒狀桿菌異染顆粒Albert染色,革蘭染色法 Gram Staining 革蘭染色法是丹麥內(nèi)科醫(yī)生 Christain Gram于1884年創(chuàng)立的一種細菌染色方法，已有130多年的歷史，仍在廣泛使用。,革蘭染色法原理的三種學(xué)說,通透性學(xué)說：G+菌細胞壁結(jié)構(gòu)比較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，酒精不易透入，反而可使細胞壁脫水而形成一道屏

6、障，阻止染料向細胞外滲。G-菌細胞壁比較疏松，肽聚糖層很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂質(zhì)，易被酒精溶解，致使細胞壁通透性增高，細胞內(nèi)的結(jié)晶紫—碘復(fù)合物容易被酒精脫出。等電學(xué)說：G+菌等電點(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，一般染色時染液的酸堿度在pH7.0左右，電離后陽性菌帶的負電荷比陰性菌多，因此與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合牢固，不易脫色?；瘜W(xué)學(xué)說：G+菌細胞內(nèi)含有某種特殊化學(xué)成分，一般認為是核糖核酸鎂鹽與多糖的復(fù)合物

7、，它與染料—媒染劑復(fù)合物結(jié)合，使已著色的細菌不易脫色。,革蘭染色的意義,鑒別細菌：把細菌分成G+和G-兩大類。選擇抗菌藥物：例如G+球菌對青霉素敏感,G-桿菌耐藥。了解細菌的致病機理：G+菌大多產(chǎn)生外毒素,G-菌產(chǎn)生內(nèi)毒素。革蘭染色的步驟 涂片 → 干燥 → 固定→ 染色,,涂片的制備 Prepare a Smear,甲→金黃，紫黑。乙→白色，粉紅。丙→金黃，紫黑。丁、戊→白色，粉紅。,↑細菌合適,↑細菌較多,①接種環(huán)

8、取鹽水3ul×2滴,水滴間距小于2cm。,②取菌苔少許（1mm小菌落半個）與鹽水混勻，涂成大于1cm2均勻涂膜。,③涂畢→環(huán)移至涂膜中央側(cè)立，待環(huán)內(nèi)菌膜破裂，接種環(huán)燒灼滅菌。,,,固定 Fixation,涂片smear,干燥dry,,,,,①手持載玻片一端，涂膜朝上，兩個涂膜快速通過火焰外層3次，時間2～3秒鐘。,②促使菌體蛋白質(zhì)凝固，固定在載玻片上，以免染色水洗的時候，細菌被水洗掉。,革蘭染色方法步驟 The Gram S

9、tain Procedure,涂片 → 干燥 → 固定→ ↓結(jié)晶紫 → 初染1分鐘→水洗→ ↓盧戈碘液→媒染1分鐘→水洗→ ↓95％乙醇→脫色約20秒鐘→水洗→ ↓稀釋品紅→復(fù)染1分鐘→水洗→ ↓ 吸干,鏡檢?！锶【m量,涂片均勻,水洗輕緩,脫色

10、適當?！镉绊懜锾m染色的關(guān)鍵步驟是涂片和脫色。,革蘭陽性菌Gram-Positive,革蘭陰性菌Gram-Negative,G+鏈球菌,G-雙球菌,G+桿菌,G+短桿菌,G-弧菌,G-螺菌,液體培養(yǎng)基接種 Broth Transfer— 懸浮法 Suspending Method,甲→金黃, 乙→白色, 丙→紫黑, 丁、戊→粉紅。標記：組號，顏色,,37℃培養(yǎng)4小時,4～5×108cfu/ml,①接種環(huán)斜面取菌，在

11、靠近培養(yǎng)基液面管壁上，上下研磨接種。,②在管壁上，將接種環(huán)內(nèi)的菌膜拍破。退出接種環(huán)，燒灼滅菌。,,,生物安全警告BIOHAZARD,本次實驗操作，可產(chǎn)生幾十至幾百個微生物氣溶膠顆粒。氣溶膠粒徑＞100um沉降很快,＜50um在0.4s內(nèi)擴散開,＜5um通過呼吸道直接到達肺泡。Pike博士對實驗室感染統(tǒng)計分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不明原因的感染高達82%，大多數(shù)是氣溶膠在空氣中擴散引起的。實驗時應(yīng)坐穩(wěn)，很專注，不分心，在火焰周圍10～20厘米

12、內(nèi)操作，保持安靜、有序，盡量少說話，以免感染病原菌。,顯微鏡油鏡的使用,將標本放置、移動到光路上，用“黃色圈”的10×物鏡找到、看清楚標本。將聚光器調(diào)到最高處。調(diào)整孔徑光闌,將與物鏡相對應(yīng)倍率調(diào)到正面（10×→100×）。在標本觀察部位上滴加一滴香柏油。將“白色圈”100×物鏡放入光路，浸泡于香柏油中，可看到模糊物象。調(diào)整亮度及微調(diào)旋鈕，直到物象清晰為止→觀察物象，記錄結(jié)果→關(guān)閉電源。

13、油鏡處理：擦鏡紙拭去香柏油 →擦鏡紙沾少許乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭→擦鏡紙擦拭油鏡。顯微鏡罩上防塵罩→ 橫放在實驗柜內(nèi)。※ (順德校區(qū)）實驗臺兩側(cè)的電源插座，只能插入一個插頭，請選擇離你最近的電源插座?！ㄐ１静浚嶒炁_中間，三個位的插座，中間那位插孔沒有電，不能使用，只能用兩側(cè)的插座。,100倍浸油物鏡使用方法,溫馨提示,因染色場地受限，甲、丙先涂片染色，后接種肉湯。乙、丁先接種肉湯，后涂片染色。待染色和肉湯接種完畢，桌

14、面收拾干凈，才可鏡檢，以免污染。鏡檢過的載玻片不必擦拭，直接投入玻片缸內(nèi)消毒、滅菌。,革蘭染色法P15 甲→金黃，紫黑 乙→金黃，紫黑 丙→白色，粉紅 丁→白色，粉紅肉湯接種法P10 甲→金黃 乙→白色 丙→紫黑 丁→粉紅油鏡的使用P13 10×物鏡→看清標本→滴加香柏油→100×油鏡→浸泡油中→模糊物象→細調(diào)節(jié)調(diào)焦，觀察物像→記錄結(jié)果

15、→關(guān)閉電源→ 擦鏡紙拭去香柏油 →擦鏡紙沾少許乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭→擦鏡紙擦拭油鏡。 聚光鏡孔徑光闌環(huán)上的物鏡倍率（10×或100×）轉(zhuǎn)到正面。,思考題,革蘭染色法的關(guān)鍵步驟是什么?為什么?染色時為什么通常要用新鮮的細菌培養(yǎng)物? 如何使用油鏡?,,,實驗小結(jié)用普通平板，從濃汁標本中分離得到金黃、白色兩種菌落，這兩株細菌，顯微鏡油鏡下均為G+球菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀，是典型的葡萄球菌。結(jié)

16、合菌落色素，這兩株葡萄球菌可能是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。,葡萄球菌(電鏡),金黃、白色形態(tài)與染色(油鏡),酸葡萄,金黃、白色菌落特征,黃色,白色,,用伊紅美藍平板,從糞便標本分離、獲得紫黑色和粉紅色半透明兩種菌落。紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大腸埃希菌。粉紅色菌落是不能分解乳糖的致病菌。顯微鏡下，均為G-桿菌，散在排列，從形態(tài)上不能鑒別是什么細菌。,桿菌(電鏡),紫黑、粉紅細菌的形態(tài)與染色(油鏡),紫黑,紫黑、粉紅菌落特征

17、,粉紅,常用器材擺放順序：電源插座→試管架→酒精燈→污物盤。試管架上器材：靠近插座一側(cè)第1列放置接種針,第2列放置接種環(huán)，另一側(cè)中間兩行放置油性筆和打火機。,※器材使用后，必須放回原處，依次擺整齊。,實驗器材 整齊有序,革蘭染色瓶,染色架,石蠟油,拭鏡紙,吸水紙,乙醇乙醚,微生物學(xué)器材柜-1（邊臺西側(cè)中段）,染色、鏡檢器材→收拾入柜→依次擺整齊,器材柜（下層）,酒精棉球 鑷子,革蘭染色瓶,載玻片,鏡油瓶,↗革蘭染色器材 收拾