第5章+遺傳圖譜

1、1第5章遺傳圖譜遺傳圖譜是應(yīng)用遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建能顯示基因以及其它序列特征在基因組上的位置的圖。遺傳學(xué)技術(shù)包括雜交育種實(shí)驗(yàn)、人類家族的系譜分析。1遺傳圖譜的標(biāo)記1.1基因基因是首先被使用的標(biāo)記。最初的遺傳圖譜是在20世紀(jì)初對果蠅等生物構(gòu)建的，使用基因作為標(biāo)記。一個(gè)遺傳性狀必須以兩種替換形式或表型存在才能用于遺傳學(xué)分析。如孟德爾首先研究的豌豆莖的高或矮。每種表型是由相應(yīng)基因的不同等位基因所決定的。起初只有那些能通過視覺區(qū)分的基因表型能用于研究

2、。比如，第一張果蠅遺傳圖顯示了負(fù)責(zé)身體顏色、眼睛顏色、翅膀形態(tài)等基因的位置，這些表型都可在低倍顯微鏡下或肉眼觀察果蠅而看到。早期覺得這種方法很精確，但遺傳學(xué)家們很快發(fā)現(xiàn)，只有有限的幾種可見表型的遺傳可用于研究，而在許多情況下，由于不止一個(gè)基因影響一個(gè)物理特征，分析起來并不太容易。例如，到1922年，有超過50個(gè)基因被定位在4條果蠅染色體上，而其中9個(gè)基因負(fù)責(zé)眼睛的顏色，想在此領(lǐng)域有所貢獻(xiàn)的每一個(gè)初涉者必須首先學(xué)會辨別果蠅眼睛的顏色是紅、

3、淡紅、朱紅、石榴石紅、康乃馨色、肉桂色、深褐色、猩紅色或深紅色。為了使基因圖更加全面，有必要找到一些比可見的性狀更多、更明確而且更簡單的性狀。解決的方法是應(yīng)用生物化學(xué)方法區(qū)分表型。這對于微生物與人類尤為重要。細(xì)菌與酵母只有為數(shù)很少的可見性狀，因此這類生物的基因作圖只能依賴于生化表型。人類以血液分型為代表的生化標(biāo)記研究從20世紀(jì)20年代就開始了。血液分型研究不僅包括如ABO系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)血型，還有血清蛋白以及人類白細(xì)胞抗原（HLA系統(tǒng)）等免疫

4、蛋白的等位基因可變體。這些標(biāo)記相對于可見表型的一個(gè)巨大優(yōu)點(diǎn)是其相關(guān)基因往往為復(fù)等位基因。HLADRB1基因至少有59個(gè)等位基因，而HLAB至少有60個(gè)。這正是與人類基因作圖相關(guān)的。與在果蠅或小鼠等生物中建立的雜交實(shí)驗(yàn)不同，人類基因遺傳的數(shù)據(jù)只能通過檢查一個(gè)家族中各成員的表型來獲得。如果對所研究的基因而言，所有的家族成員都為純合子，就得不到有用的信息。這對于只有兩個(gè)等位基因的基因較為常見。因?yàn)榛榕渑既坏匕l(fā)生于同一個(gè)等位基因純合子個(gè)體之間。

5、而當(dāng)所研究的基因有60個(gè)而不是2個(gè)等位基因時(shí)，這就很少見了。1.2DNA標(biāo)記基因是非常有用的標(biāo)記，但絕不是理想的。特別是對于像脊椎動物及開花植物的較大3凝膠電泳是分離不同長短DNA分子和RNA分子的標(biāo)準(zhǔn)方法。電泳是帶電分子在電場中的運(yùn)動。帶負(fù)電荷的分子（如DNA）向陽極移動，帶正電荷的分子則向陰極移動。電泳技術(shù)起初是在水溶液中進(jìn)行的，但對DNA分子的分離來說，這樣并不適用，因?yàn)樵谒芤褐杏绊戇w移率的主要因素是分子形狀和它所帶的電荷。而大

6、多數(shù)DNA分子性狀相同（線性），雖然其所帶電荷依賴于它的長度，但由此產(chǎn)生的電荷差異不足以產(chǎn)生有效的分離。當(dāng)電泳在凝膠中進(jìn)行時(shí)，情形就有所不同，此時(shí)分子形狀和電荷的影響降低，而分子長度成為決定遷移率的最重要因素。因?yàn)槟z形成一個(gè)網(wǎng)狀孔道，DNA分子從中穿過到達(dá)陽極。較短的分子受孔道的阻礙較小，能夠比較長的分子更快地穿過凝膠。從而不同長度的分子在凝膠上形成不同的條帶。制備瓊脂糖凝膠時(shí)，將適量瓊脂糖粉末混入緩沖液中，加熱使其溶解，然后將熔化的

7、凝膠注入到有機(jī)玻璃板上，板四周用膠帶封閉以防止?jié)B漏。在膠中插入梳子以形成加樣孔。待凝膠凝固后，將其置于緩沖液中進(jìn)行電泳。加樣前，向DNA樣品中加入一種或兩種已知遷移率的染料，便于電泳過程中觀察進(jìn)度。電泳完畢后，將凝膠浸泡于溴化乙錠溶液中使DNA帶顯現(xiàn)，因?yàn)殇寤义V可嵌入DNA分子堿基對間，并在紫外線照射下發(fā)出熒光。第三步：Southern印跡由于瓊脂糖凝膠易碎，不便于隨后的分子雜交操作，所以需要將凝膠上的片段轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。第四步：分子

8、雜交雜交探針是一個(gè)被標(biāo)記的DNA分子，其序列與我們希望檢測的靶DNA互補(bǔ)，它們能形成堿基配對，因此能通過檢測探針上的標(biāo)記發(fā)出的信號來確定靶限制性片段在膜上的位置。探針可以是合成的寡核苷酸或克隆的DNA片段。為檢測RFLP，探針通常是覆蓋多態(tài)限制位點(diǎn)的克隆的DNA片段。將膜置于含標(biāo)記探針以及一些緩沖液的玻璃瓶中，將玻璃瓶緩慢旋轉(zhuǎn)數(shù)小時(shí)以使探針有充分時(shí)間與其靶DNA雜交，洗膜以去除雜交的探針，然后檢測信號。探針通常是放射性標(biāo)記的，信號通過放