細菌與病毒的微生物學檢查法

1、第七章細菌與病毒的微生物學檢查法,微生物學教研室Jiz-Zhaoj12zhao@aliyun.com,教學大綱,掌握內容標本的采集和送檢原則病原菌的檢驗程序細菌感染的血清學診斷及常用方法了解內容病原體的抗原成分、核酸及其他成分的檢測方法,病原學檢查的目的,進行病因學診斷指導合理用藥觀察治療進行傳染病的流行病學調查,,標本的采集和送檢六原則※,無菌操作：避免雜菌污染,不同期不同標本,用抗生素以前,采集病變明顯部位,

2、,,,,,,,,,,,,運送注意保存,采集雙份血清,第一節(jié) 細菌感染的微生物學檢查法,可疑細菌感染,,采集標本,,,血清學實驗雙份血清,直接形態(tài)學檢查,細菌成分檢測,,特異性抗體檢測,,細菌分離培養(yǎng),,鑒定,,,形態(tài)學檢查生化學檢查血清學鑒定藥物敏感實驗動物（毒力）實驗,,,抗原檢測,核酸檢測,,,直接凝集實驗協(xié)同凝集實驗乳膠凝集實驗免疫熒光檢測ELISA等,核酸雜交聚合酶鏈反應（PCR）DNA芯片,凝集反應沉

3、淀反應補體結合試驗中和試驗ELISA等,,,,,,,細菌學 診斷,檢測病原菌成分,檢測患者血清中特異性抗體,,細菌病原學檢查法,形態(tài)學檢查分離培養(yǎng),純培養(yǎng)生化試驗血清學鑒定藥物敏感試驗毒力實驗動物實驗,,抗原,核酸,一、細菌學診斷,（一）形態(tài)學檢查,光學顯微鏡檢查法：細菌染色檢查法革蘭染色法抗酸染色法負染法暗視野檢查：用于檢查活菌、螺旋體及其動力熒光顯微鏡,腦脊液的直接涂片染色-肺炎鏈球菌,,鏈球菌,淋

4、病奈瑟球菌-膿液直接涂片,結核分枝桿菌,霍亂弧菌,,暗視野顯微鏡,鉤端螺旋體,肺炎雙球菌,病原菌的分離培養(yǎng)/直接涂片,大小形態(tài)顏色表面性狀透明度溶血性,Flame sterilize wire loop, metal forceps, etc before and after use in a hooded Bunsen burner,細菌動力的檢測,化膿性球菌,葡萄球菌,鏈球菌,腸道桿菌,大腸埃希菌,沙門氏菌,志賀菌,細菌形

5、態(tài)無特異性可采用生化學檢查法-鑒別細菌的重要方法,（二）生化試驗,糖發(fā)酵試驗 H2S試驗 枸櫞鹽利用試驗,鑒定中最重要的生化反應※,乳糖發(fā)酵試驗,腸道非致病菌（埃希菌屬）發(fā)酵乳糖、產酸產氣＋,腸道致病菌（志賀菌屬、沙門菌屬等）不發(fā)酵乳糖 —,,,,,（三）血清學鑒定,利用含已知的特異性抗體的免疫血清，檢測未知的細菌抗原，對細菌進行種的鑒定 志賀菌屬、沙門菌屬常用方法是玻片凝集試驗,測定抗生素或其他抗微

6、生物制劑在體外抑制細菌生長的能力方法： 擴散法、稀釋法,（四）藥物敏感試驗,MIC & MBC,最低抑菌濃度，MIC最低殺菌濃度，MBC,全自動分析儀,全自動細菌鑒定儀,全自動生化分析儀,（五）檢測毒力-動物實驗,1. 常用動物　 Mouse　Guinea Pig　 Rabbit Dog Monkey,接種途徑,皮內 皮下 腹膜內 靜脈 顱內 椎管內 鼻內 灌胃,毒力檢測,半數(shù)致死量 LD50半

7、數(shù)感染量 ID50,二、檢測病原菌成分,抗原的檢測核酸的檢測,（一）抗原的檢測,利用已知的特異性Ab檢測Ag的方法常用的方法有玻片凝集協(xié)同凝集試驗ELISA免疫熒光法,ELISA,（二）核酸檢測方法,聚合酶鏈反應（PCR）核酸雜交技術Southern blotNorthern blotDot blotIn situ hybridization基因芯片(Gene chip)16S rRNA,16sRNA基因序列

8、分析,只存在于原核細胞型微生物的染色體基因中16sRNA，23sRNA, 5sRNA可變區(qū)和保守區(qū)保守區(qū)：所有的細菌所共有可變區(qū)：屬和種的特異性,PCR,Gene Chip,,,三、抗體的檢測,用已知細菌或其Ag檢測相應的特異性Ab及其量的多少，作為某些病原菌感染的輔助診斷急性期和恢復期雙份血清，恢復期效價升高≥4倍有診斷價值方法玻片或試管凝集試驗、沉淀試驗、補體結合試驗、 冷凝集試驗、ELISA局限難以早期

9、診斷,第二節(jié) 病毒感染的微生物學檢查法,形態(tài)學病毒的分離鑒定在培養(yǎng)細胞中增殖的鑒定指標病毒成分的檢測病毒抗體的檢測,,（一）病毒的形態(tài)學檢查,電子顯微鏡（ EM） 免疫電鏡, IEM光學顯微鏡（CM）包涵體內基小體（Negri body）,HAV,Negri body,動物接種：動物模型,雞胚接種： 9～14d,組織培養(yǎng),器官培養(yǎng),組織培養(yǎng),細胞培養(yǎng),原代細胞培養(yǎng),,二倍體細胞培養(yǎng),傳代細胞培養(yǎng),三大培養(yǎng)方法,（二）病毒

10、的分離培養(yǎng)的方法,,,血凝抑制實驗中和實驗PCR檢測,,,,病毒分離培養(yǎng)及鑒,細胞病變（cytopathy) ※紅細胞吸附 (hemadsorption)病毒干擾作用 (viral interference)中和試驗 (neutralization test, NT)空斑形成試驗 (plaque formation),病毒在培養(yǎng)細胞中增殖的鑒定指標※,細胞病變—細胞病變效應※（CPE）,細胞病變紅細胞吸附：血凝素（HA）

11、病毒干擾作用中和試驗病毒數(shù)量及感染性的檢測空斑形成試驗紅細胞凝集,紅細胞吸附,病毒在培養(yǎng)細胞中增殖的鑒定指標,,plaque,空斑形成試驗,用于病毒濃度的精確定量和測定抗病毒藥物的作用一個空斑是由一個病毒大量復制而成，稱為空斑形成單位（Plaque forming unit，PFU）。病毒的感染量用PFU/ml表示,（三）病毒成分的檢測,病毒抗原的檢測: ELISA 病毒核酸的檢測 核酸雜交、PCR、 基因芯片,

12、病毒成分的檢測,（四）病毒抗體的檢測,中和試驗（NT）血凝抑制試驗（HT）補體結合試驗（CF）ELISA法蛋白印跡技術,小 結,細菌感染的微生物學檢查法病原體檢查核酸的檢測抗原、抗體的檢測病毒感染的微生物學檢查法電鏡及免疫電鏡病毒的分離培養(yǎng)和鑒定核酸的檢測抗原、抗體的檢測,小結,抗細菌免疫固有免疫※獲得性免疫抗病毒免疫固有免疫干擾素※獲得性免疫,問 題,采集標本的原則？病毒在培養(yǎng)細胞中增殖的鑒定指

13、標？干擾素的概念及其抗病毒機制,自檢內容,1. 機體抗結核分枝桿菌的感染免疫主要依賴A. 屏障結構 B. 細胞免疫 C.抗體的中和作用D.非特異性免疫分子 E. 吞噬細胞的吞噬作用2. 滅活和清除游離病毒主要依靠A.干擾素 B.抗體 C.細胞因子 D.非特異性免疫分子 E.皮膚粘膜屏障,自檢內容,3. 抑制病毒的增殖，保護鄰近細胞免疫受病毒感染的抗病毒作用機制是 A. 抗體 B. NK細胞 C.細胞因子 D.干擾素 E.C